Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Хлорамфеникол (лат. Chloramphenicol) – бактериостатический антибиотик широкого спектра действия (рис. 17), впервые полученный из актиномицета Streptomyces venezuelae. Активен в отношении многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, риккетсий, спирохет и проч. Механизм антибактериального действия связан с нарушением синтеза белка в бактериальной клетке на стадии пептидил-трансферазной реакции, протекающей в рибосоме. Резистентность бактериальных клеток к хлорамфениколу (CmR) обусловливается наличием гена (cat), кодирующего хлорамфеникол-ацетилтрансферазу.

Необходимо подчеркнуть, что все приведенные выше антибиотики не оказывают никакого влияния на жизнедеятельность дрожжевых клеток. Для того чтобы продемонстрировать нечувствительность дрожжевых клеток к наиболее распространенным в лабораторной практике бактериальным антибиотикам, в настоящий практикум включена задача по совместному выращиванию дрожжевых и бактериальных клеток на плотных селективных средах. С учетом того что на бактериальных ростовых средах (например, LB) выращивание дрожжевых клеток затруднено, в качестве среды, подходящей для культивирования обоих видов клеток, выбрана плотная среда YPD, дополненная антибиотиками.

Рис. 17. Структура хлорамфеникола

Материалы и оборудование

• Автоматические пипетки объемом до 0,02 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Наконечники объемом до 0,01 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Стерильный бокс или ламинарный шкаф.

• Пипетки стерильные различного объема.

• Чашки Петри с залитыми плотными средами YPD: без антибиотиков и дополненные ампициллином, канамицином, хлорамфениколом по одной чашке, 4 шт.

• Шпатель Дригальского.

• Микробиологические петли одноразовые или многоразовые.

• Пинцет лабораторный.

• Спиртовка, этанол 90 %-ный, тампоны ватные.

• Карандаш, ручка, лабораторный журнал.

• Культура бактериальных клеток штамма JM-109 E. coli.

• Культура дрожжевых клеток S. сerevisiae.

• Чашка Петри с выросшей культурой трансформантов (см. Лабораторную работу 13) или (в зависимости от компановки лабораторных работ в практикуме) клеточные суспензии пересеянных трансформантов (см. Лабораторную работу 15).

Поставленные задачи

1. Засеять клетки чистого штамма JM-109 E. coli на плотные селективные среды YPD, содержащие антибиотики ампициллин, канамицин, хлорамфеникол, а также на чашку YPD без антибиотиков.

2. Пересеять отдельные клоны трансформантов с чашки Петри, полученной в Лабораторной работе 13, на плотные селективные среды YPD, содержащие антибиотики ампициллин, канамицин, хлорамфеникол, а также на чашку YPD без антибиотиков.

3. Засеять дрожжевые клетки S. сerevisiae на плотные селективные среды YPD, содержащие антибиотики ампициллин, канамицин, хлорамфеникол, а также на чашку YPD без антибиотиков.

Ход работы

1. В микропробирку с замороженными клетками чистого штамма JM-109 E. coli погрузить одноразовую (или простерилизованную) микробиологическую петлю и рассеять клетки истощающим штрихом, проводя петлей по поверхности плотной среды YPD, дополненной ампициллином (чашка из Лабораторной работы 15). Посев должен занимать не более чем ~1/3 чашки, границы засеянной области отметить линиями на дне чашки и подписать.

2. Аналогичным образом засеять ~1/3 площади поверхности чашек Петри с плотными селективными средами YPD, содержащими антибиотики канамицин и хлорамфеникол и с неселективной YPD.

3. В микропробирку объемом 1,5 мл перенести ~1 мл жидкой среды LB, микробиологической петлей отобрать с чашки Петри несколько произвольных колоний (соскоб), внести петлю в 1 мл жидкой среды и тщательно ресуспендировать. Этой же петлей рассеять клетки на поверхности (~1/3 площади) чашек Петри с плотной средой YPD с канамицином и хлорамфениколом и с неселективной YPD. Границы засеянной области отметить линиями на дне чашки и подписать.

4. В микропробирку с замороженными дрожжевыми клетками S. сerevisiae погрузить одноразовую (или простерилизованную) микробиологическую петлю и рассеять клетки истощающим штрихом, проводя петлей по поверхности плотной среды YPD, дополненной ампициллином (чашка из Лабораторной работы 15), а также по поверхности чашек с канамицином и хлорамфениколом и с неселективной YPD (на оставшиеся ~1/3 каждой чашки), затем подписать засеянный сегмент.

5. Все чашки Петри инкубировать при 30 °C в термостатированном шкафу в течение 24–36 ч или при комнатной температуре в течение двух суток.

Полученные результаты

1. Чашка Петри c дополненной антибиотиком ампициллином плотной средой YPD, засеянная клеточными культурами (на каждую 1/3 поверхности чашки): а) трансформантов; б) чистого штамма JM-109 E. coli; в) дрожжей.