Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

2. Чашка Петри с дополненной антибиотиком канамицином плотной средой YPD, засеянная клеточными культурами (на каждую 1/3 поверхности чашки): а) трансформантов; б) чистого штамма JM-109 E. coli; в) дрожжей.

3. Чашка Петри с дополненной антибиотиком хлорамфениколом плотной средой YPD, засеянная клеточными культурами (на каждую 1/3 поверхности чашки): а) трансформантов; б) чистого штамма JM-109 E. coli; в) дрожжей.

4. Чашка Петри с плотной средой YPD без антибиотиков, засеянная клеточными культурами (на каждую 1/3 поверхности чашки): а) трансформантов; б) чистого штамма JM-109 E. coli; в) дрожжей.

Вопросы по теме

1. Назовите наиболее часто используемые в лабораторной практике антибиотики.

2. С какой целью антибиотики добавляют в ростовые среды?

3. Чем отличается бактериостатическое действие антибиотиков от бактерицидного?

4. Почему антибиотики, к которым чувствительны клетки чистых культур E. coli, не оказывают влияния на дрожжевые культуры?

5. Что кодируют гены устойчивости к ампициллину AmpR, канамицину KanR и хлорамфениколу CmR? Опишите механизмы устойчивости бактерий к этим антибиотикам.

Лабораторная работа 17. Способы хранения бактериальных культур: на чашках Петри, в столбиках с агаром, криоконсервация

Цель работы

Изучить и сопоставить способы хранения бактериальных культур с использованием криоконсервации, чашек Петри и столбиков агара. Приготовить агаровые столбики и криосток с бактериальными клетками.

Введение

При культивировании клеток микроорганизмов в каждом конкретном случае необходимо уделять существенное внимание надежности, эффективности и адекватности методов хранения. Неверный выбор условий хранения может привести к изменению свойств клеточных культур, например, к приобретению случайных мутаций, к загрязнению клеточной культуры посторонними микроорганизмами и, наконец, к ее гибели. Способы хранения клеточных культур микроорганизмов можно разделить на две большие группы по продолжительности.

Характерной чертой методов краткосрочного хранения является нахождение клеточных культур в подходящих для них питательных средах. Самым простым и очевидным – однако и наименее длительным – методом хранения является субкультивирование, или периодический пересев клеток в свежие среды. Срок, по истечении которого необходимо произвести очередной пересев, зависит от многих факторов, в первую очередь от специфики данного вида бактерий, и может составлять от нескольких дней до нескольких месяцев. Увеличение частоты пересевов без необходимости может привести к отбору и закреплению случайных мутаций, что изменит свойства клеточной культуры. Следует отметить, что для снижения вероятности неселективного отбора и закрепления случайной мутации при пересеве для инокуляции используют не единичную колонию, а отбирают несколько изолированных.

Для снижения частоты пересевов клеточных культур создают условия, в которых максимально замедляются скорость метаболических процессов в клетках, их рост и деление. С этой целью предпочтительно используют пересевы на обедненные и плотные ростовые среды, хранение при пониженных положительных температурах (4–6 °C) и в анаэробных условиях. Так, одним из самых распространенных краткосрочных методов является хранение культур микроорганизмов на поверхности плотной среды в чашках Петри при 4–6 °C, что позволяет сохранять бактерии в жизнеспособном состоянии до 4–5 недель. Хранение культур в столбиках или косяках агара позволяет увеличить время между пересевами до нескольких месяцев. Анаэробные условия служат дополнительным фактором, увеличивающим срок хранения клеточных культур как в жидких средах, так и в плотных. Для создания бескислородных условий наслаивают стерилизованное минеральное масло на среду с клеточной культурой – жидкую клеточную суспензию или агаровый столбик – и хранят в вертикальном положении при 4–6 °C.

К достоинствам этой группы методов хранения относятся сравнительная простота и отсутствие необходимости использовать дорогостоящее оборудование. Однако есть и существенные недостатки: повышение вероятности контаминации клеточной культуры с ростом количества пересевов, возможный отбор случайных мутаций, возможная потеря клеточной культуры при ошибках технического характера и проч.

Методы долгосрочного хранения предполагают физиологически неактивное состояние бактерий – высушенное или замороженное. Для получения высушенных препаратов бактериальных клеток используется лиофилизация – метод, широко применяемый также для высушивания препаратов биомолекул – белков, пептидов, нуклеиновых кислот и проч. Он заключается в возгонке (сублимации) воды при пониженном давлении из твердого состояния (льда) в газообразное (пар), минуя жидкую фазу, и осуществляется в специальной установке – лиофильной сушке. Лиофилизированные клеточные культуры хранятся в укупоренных стерильных флаконах при пониженных температурах 4–6 °C в течение нескольких лет и в заморозке – десятки лет.

Наиболее распространенным способом длительного хранения клеточных культур является быстрое замораживание при –70 °C или –80 °C (в низкотемпературном холодильнике) или ультразамораживание в жидком азоте при –196 °C. Полученные таким способом образцы называют криостоками. Ультразамороженные криостоки хранят в парах жидкого азота в специальных хорошо изолированных резервуарах – сосудах Дьюара.

При замораживании клеток микроорганизмов возникает проблема защиты клетки от повреждений образующейся кристаллической структурой льда. На сегодняшний день известны клеточные криопротекторы двух типов. К первому типу относятся трехатомный спирт глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО), которые легко преодолевают клеточную мембрану и, попадая в клетку, обеспечивают как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замораживания. Это наиболее эффективные и распространенные в применении криопротекторы, подходящие для широкого круга бактериальных культур. Перед добавлением к клеточной культуре криопротекторы стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр и добавляют в суспензию клеток в концентрации 5–10 % (объем/объем).

Криопротекторы второго типа обеспечивают защиту от кристаллов льда только на наружной поверхности клеточной мембраны. К этому типу относятся сахароза, лактоза, глюкоза, манит, сорбит, декстран, поливинилпирролидон и полигликоль и проч.

Необходимо отметить, что для приготовления криостоков лучше подходят клеточные культуры, находящиеся в середине или в конце экспоненциальной фазы роста. В таком случае количество выживших после замораживания и последующей разморозки клеток в образце будет выше. По окончании хранения клеточные культуры быстро размораживают, как правило, при 37 °C, в результате чего культура восстанавливает свою жизнеспособность. Для определения эффективности метода хранения в каждом образце определяют количество жизнеспособных клеток.

В целом по сравнению с периодическим пересевом методы долгосрочного хранения клеточных культур являются более надежными и долгосрочными (теоретически срок хранения замороженных культур не ограничен), однако требуются специальное дорогостоящее оборудование и соблюдение надлежащих условий хранения криостоков.

Материалы и оборудование

• Автоматические пипетки объемом до 0,02 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Наконечники объемом до 0,01 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Стерильный бокс или ламинарный шкаф.

• Пипетки стерильные различного объема.

• Микробиологические петли одноразовые стерильные или многоразовые.

• Пинцет лабораторный.