Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

I. С чашки Петри, полученной в ходе Лабораторной работы 13, пересеять трансформанты бактериальных клеток, содержащих плазмидную ДНК с геном флуоресцентного белка, в жидкую среду LB и на поверхность плотной среды, дополненные антибиотиком ампициллином.

1. Внимательно осмотреть закрытую чашку Петри с выросшими колониями трансформантов и выбрать одну изолированную колонию, удовлетворяющую всем требованиям (см. выше). Отметить выбранную колонию, прикасаясь ко дну чашки маркером напротив этой колонии, или обвести ее тонкой линией.

2. В стерильную пробирку объемом 15 мл перенести 3 мл жидкой среды LB, из приготовленного ранее стокового раствора добавить необходимое количество антибиотика ампициллина до конечной концентрации 100 мкг/мл.

3. В стерильном боксе или ламинарном шкафу открыть чашку Петри, стерильной микробиологической петлей прикоснуться к центру отмеченной колонии (сколоть), затем внести петлю в приготовленную пробирку, содержащую 3 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл). Для успешного пересева достаточно погрузить петлю в жидкую среду.

4. Этой же петлей методом истощающего штриха рассеять клетки по поверхности плотной среды в новой чашке Петри с плотной селективной средой YPD, содержащей антибиотик ампициллин (100 мкг/мл). Посев должен занимать не более чем ~1/3 поверхности чашки; границы засеянной области отметить линиями на дне чашки и подписать.

5. Пробирку с пересеянными в жидкую среду трансформантами инкубировать в течение 16–18 ч при 37 °C с интенсивным перемешиванием (250 об/мин) в инкубаторе-шейкере, а чашки Петри с плотными средами – при 37 °C в термостатированном шкафу в течение 16–18 ч или при комнатной температуре в течение двух суток.

II. Нарисовать любой рисунок по поверхности плотной среды в чашке Петри клеточными культурами, содержащими плазмиды с генами различных флуоресцентных белков. Для этого в микропробирку объемом 1,5 мл перенести ~1 мл жидкой среды LB, микробиологической петлей отобрать с плотной среды на чашке Петри несколько произвольных колоний (соскоб), внести петлю в 1 мл жидкой среды и тщательно ресуспендировать*. Этой же петлей нанести рисунок на поверхность плотной среды (LB с ампициллином) в новой чашке Петри.

*Для нанесения рисунка также можно воспользоваться предварительно выращенными в жидкой селективной среде клеточными культурами соответствующих трансформантов.

III. Все засеянные чашки Петри инкубировать при 37 °C в термостатированном шкафу в течение 16–18 ч или при комнатной температуре в течение двух суток.

Полученные результаты

1. Чашка Петри с плотной средой YPD, дополненной антибиотиком ампициллином, засеянная культурой трансформированных клеток (1/3 поверхности чашки) с помощью техники истощающего штриха.

2. Пробирка объемом 15 мл с 3 мл жидкой среды LB, дополненной антибиотиком ампициллином и засеянной культурой трансформированных клеток.

3. Чашка Петри с плотной средой LB, дополненной антибиотиком ампициллином, с рисунком по поверхности среды, выполненным клеточной суспензией трансформантов (пример см. на илл. 7Б).

Вопросы по теме

1. Каковы критерии отбора отдельной колонии бактерий с плотной среды в чашке Петри для пересева?

2. Почему для пересева трансформированных бактериальных клеток важно отобрать отдельную колонию?

3. Что такое сателлитные колонии и каковы условия их образования на плотной среде в чашке Петри?

4. Для чего осуществляют пересевы (субкультивирование) бактериальных клеточных культур?

Лабораторная работа 16. Определение чувствительности бактерий E. coli чистого штамма и после трансформации плазмидой с геном антибиотикорезистентности, а также дрожжевых клеток S. сerevisiae к бактериальным антибиотикам

Цель работы

Изучить и сопоставить способность к росту бактериальных и дрожжевых клеточных культур на плотных средах с различными бактериальными антибиотиками.

Введение

В микробиологии, биотехнологии и молекулярной биологии широко используется культивирование микроорганизмов на ростовых средах, дополненных тем или иным антибиотиком, что позволяет селективно выращивать только определенный вид микроорганизмов, обладающих устойчивостью к данному антибиотику. В общем случае антибиотиками называют вещества природного или (реже) синтетического происхождения, способные в относительно небольших концентрациях подавлять рост микроорганизмов (бактериостатическое действие) или вызывать их гибель (бактерицидное действие). К наиболее часто используемым в лабораторной практике относятся антибиотики ампициллин, канамицин, хлорамфеникол.

Ампициллин (лат. Ampicillinum) – полусинтетический бета-лактамный антибиотик пенициллинового ряда (рис. 15), по механизму действия аналогичен первому из известных антибиотиков – пенициллину, необратимо ингибирует транспептидазу, участвующую в синтезе пептидогликана клеточной стенки, что приводит к прекращению роста (бактериостатик) и последующему (при длительном воздействии) лизису бактериальной клетки. Ампициллин активен в отношении ряда грамотрицательных и некоторых грамположительных микроорганизмов, поэтому является антибиотиком широкого спектра действия. Бета-лактамные антибиотики расщепляются под действием β-лактамаз бактерий, с чем связаны механизмы устойчивости бактериальных клеток к этому классу антибиотиков.

Лабораторные штаммы E. coli, как правило, не синтезируют собственные лактамазы и, следовательно, неустойчивы к действию ампициллина. В ходе трансформации бактерий плазмидными векторами, несущими селективный маркер (ген устойчивости к ампициллину (bla), который представляет собой ген фермента β-лактамазы), клетки, поглотившие плазмидную ДНК, начинают продуцировать β-лактамазу и, таким образом, приобретают устойчивость к ампициллину (AmpR). При высеве таких клеток на среду, дополненную ампициллином, осуществляется селекция клеток по способности вырастать на такой среде, т. е. отбор трансформированных плазмидой клеток.

Рис. 15. Структура ампициллина

Канамицин (лат. Kanamycin A) – аминогликозидный антибиотик I поколения (рис. 16), в том числе противотуберкулезный препарат. Продуцируется актиномицетом Streptomyces kanamyceticus или другими родственными микроорганизмами. Канамицин – антибиотик широкого диапазона, способен оказывать бактерицидное действие как на грамположительные, так и на грамотрицательные микроорганизмы. К канамицину устойчивы анаэробные бактерии, дрожжи, вирусы и большинство простейших. Механизм действия заключается в связывании с 30S субъединицей рибосомы, что приводит к ингибированию синтеза белка в бактериальной клетке. Резистентность бактериальных клеток к канамицину (KanR и KmR) обусловливается наличием генов (kan), кодирующих аминогликозид-31-фосфо-трансферазы I и II. Эти ферменты способны фосфорилировать аминогликозидные антибиотики, в том числе канамицин, и тем самым инактивировать их.

Рис. 16. Структура канамицина