Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

3. Чашка Петри с плотной средой LB с ампициллином, засеянная клеточной культурой трансформантов (см. илл. 7Б).

Вопросы по теме

1. Что такое трансформация бактериальной клетки?

2. Назовите и опишите естественные процессы, обеспечивающие горизонтальный перенос генов у бактерий.

3. Что такое естественная и индуцированная компетентность бактерий и чем они отличаются?

4. Какие способы приготовления компетентных клеток используются в современной практике? Опишите каждый из способов.

5. Что происходит с бактериальной клеточной стенкой во время теплового шока?

6*. Назовите достоинства и недостатки использования генетически кодируемых флуоресцентных белков при прижизненном окрашивании клеток.

*Дополнительный вопрос повышенной сложности.

Лабораторная работа 14. Определение титра клеточной культуры методом посева бактериальных клеток после серии разведений (чашечный метод Коха)

Цель работы

В ходе эксперимента определить титр жизнеспособных клеток (чашечный метод Коха) на примере клеток E. coli, хранящихся при –80 °C.

Введение

После пересева клеточной культуры на жидкую ростовую среду бактериальные клетки проходят период адаптации к новым условиям. Первая фаза роста (фаза I, см. рис. 14) характеризуется крайне низкой скоростью деления клеток и называется латентной или лаг-фазой. Затем наступает следующая фаза – быстрого экспоненциального роста, или логарифмическая (II–IV); иногда в ней выделяют начало фазы, фазу постоянной максимальной скорости роста (линейную фазу) и фазу замедления. Время, необходимое для удвоения числа клеток в III фазе роста, называют временем генерации или временем удвоения. На этом этапе питательные вещества потребляются с максимальной скоростью, пока какое-то из необходимых соединений не начнет истощаться, что влечет за собой снижение скорости роста (фаза IV). Замедление роста из-за постепенного уменьшения содержания питательных веществ приводит к стационарной фазе (фаза V): в ней клетки начинают расщеплять белки, не являющиеся строго необходимыми. Когда запас питательных веществ в ростовой среде исчерпывается, наступает фаза отмирания (фаза VI), характеризующаяся постепенным снижением числа клеток в бактериальной культуре. Совокупность перечисленных фаз представляет собой ростовой цикл клеточной культуры при периодическом культивировании. Поскольку ростовой цикл любой клеточной культуры ограничен временными рамками, для дальнейшей культивации требуется пересев клеток на свежую питательную среду – субкультивирование.

Рис. 14. Типичная ростовая кривая бактериальной культуры и ее основные фазы

Определение параметров клеточной культуры на протяжении ростового цикла важно для эффективного субкультивирования бактериальных клеток. Кроме того, в разные фазы роста в зависимости от скорости деления клетки метаболические и морфологические свойства бактерий различаются, вследствие чего их поведение может также сильно изменяться. Обычно это учитывают при проведении молекулярно-биологических и биотехнологических экспериментов. Например, известно, что в середине логарифмической фазы роста активно делящиеся бактериальные клетки обладают наименее ригидными клеточными мембранами, что делает их наиболее подходящими (после соответствующей обработки) для трансформации экзогенной ДНК; в этой же ростовой фазе для достижения максимально эффективной экспрессии генов рекомбинантных белков в культурах штаммов-продуцентов осуществляют индукцию экспрессии; проводят отбор посевного материала для субкультивирования и т. п. Таким образом, очевидно, что необходимо контролировать состояние клеточной культуры на каждом этапе ростового цикла. Для определения фаз роста клеточной культуры и построения ростовой кривой экспериментально выявляют количество жизнеспособных клеток в единице объема через заданные временные интервалы. Стоит отметить, что для экспресс-оценки жизнеспособностью иногда пренебрегают, определяя рост клеток микроорганизмов в суспензии по мутности среды, в частности, численно по оптической плотности среды при ~600 нм.

Титром клеток называют их количество в единице объема клеточной культуры. В общем случае существуют прямые и косвенные методы определения количества клеток в культурах. Прямые методы подсчета эукариотических клеток с использованием микроскопа и счетных камер обсуждались в Лабораторной работе 3, эти же методы применимы и к прокариотическим клеткам. Однако с помощью прямых методов определяют в основном общее количество (или титр) клеток в единице объема культуры, тогда как наибольший практический интерес представляет определение титра жизнеспособных клеток.

Наиболее известный метод определения титра жизнеспособных клеток в суспензии – чашечный метод Коха: высев небольшого фиксированного объема суспензии бактерий на поверхность плотной ростовой среды в чашках Петри и последующий подсчет выросших колоний. При этом считается, что каждая колония представляет собой потомство одной жизнеспособной клетки. Поскольку даже в самом небольшом объеме клеточной суспензии содержится очень большое количество клеток, перед высевом готовят серию последовательных разведений клеточной культуры в ростовой среде LB. Всего делают не менее трех разведений с шагом 100:1 или не менее шести – с шагом 10:1. Разведение считается достаточным, если на чашке Петри вырастает от нескольких десятков до нескольких сотен колоний, т. е. количество, которое легко поддается счету. Посев на поверхность плотной среды осуществляют шпателем Дригальского, отбирают образцы, как правило, из последнего разведения. Для получения статистически достоверных данных по возможности делают несколько параллельных посевов на отдельные чашки.

Таким образом, определение титра жизнеспособных клеток можно разбить на три этапа: 1) приготовление серии разведений исследуемой клеточной культуры; 2) посев на поверхность плотной среды в чашках Петри образца из последнего разведения; 3) подсчет выросших на чашке колоний, обработка результатов.

При расчете титра жизнеспособных бактериальных клеток в 1 мл исходной суспензии суммируют результаты параллельных посевов из одного и того же разведения и определяют среднее количество выросших колоний для данного разведения. Титр жизнеспособных клеток определяют по формуле:

М = (а × 10n)/V,

где М – количество (титр) клеток в 1 мл; а – среднее количество колоний, выросших в чашках; V – объем взятой для посева клеточной суспензии (мл); 10 – коэффициент разведения; n – степень разведения.

Материалы и оборудование

• Автоматические пипетки объемом до 0,02 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Наконечники объемом до 0,01 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Стерильный бокс или ламинарный шкаф

• Пипетки стерильные различного объема.

• Чашки Петри с плотной средой LB без добавления антибиотика, 2 шт.

• Стерильная жидкая среда LB.