Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

4. Почему при пересеве клеток чистого штамма с плотной среды нельзя отбирать единичные колонии?

5. Назовите достоинства и недостатки краткосрочных и долгосрочных методов хранения.

Лабораторная работа 18. Окрашивание дрожжевых и бактериальных клеток: получение препаратов клеточных культур методом раздавленной капли, просмотр препаратов при помощи светового микроскопа

Цель работы

Научиться готовить препараты для микроскопического исследования бактериальных (E. coli) и дрожжевых (S. cerevisiae) клеток методом раздавленной капли. Изучить препараты, записать наблюдаемую картину и зарисовать микрокартину дрожжевых клеток, полученную с увеличением 100х.

Введение

Клетки микроорганизмов визуализируют при помощи световой микроскопии как в живом, так и в фиксированном состоянии с использованием специально приготовленных препаратов. Дрожжевые клетки лучше рассматривать в живом виде на препарате, приготовленном методом раздавленной капли.

Типичные размеры клеток дрожжей S. сerevisiae порядка нескольких микрометров (2–10 мкм), хотя некоторые виды дрожжей могут достигать десятков микрометров (40–50 мкм). По форме дрожжевые клетки разнообразны – почти круглые, овальные, продолговатые, цилиндрические, треугольные и т. п. При наблюдении в световом микроскопе препаратов живых дрожжевых клеток хорошо визуализируются их форма, размеры, некоторые детали внутреннего строения – ядро, клеточная стенка.

Поскольку бактериальные клетки E. coli имеют существенно меньшие размеры – от 0,4 до 0,8 мкм в ширину и от 1 до 3 мкм в длину, – при помощи световой микроскопии их чаще визуализируют в фиксированном виде на окрашенных препаратах. При этом можно получить информацию о форме и размерах клеток. В живом виде на препаратах, приготовленных методом раздавленной капли, эти бактерии визуализируют для определения жизнеспособности – по их способности к движению.

Для приготовления препарата методом раздавленной капли на предметное стекло наносят каплю стерильной воды, в которую вносят небольшое количество исследуемой культуры дрожжей, взятых с плотной питательной среды или отобранных из клеточной суспензии. Суспензия клеток после внесения в каплю на стекле должна выглядеть слегка мутноватой. При микроскопии дрожжевых клеток в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество красителя метиленового синего (рис. 18) по Леффлеру и всю смесь тщательно размешивают. Приготовленную таким образом смесь накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом вначале с увеличением 40х, а затем с иммерсионным объективом 100х.

Прижизненную окраску дрожжевых клеток метиленовым синим применяют для выявления нежизнеспособных клеток, окрашивающихся в синий цвет, что позволяет оценить физиологическое состояние дрожжевой культуры. Жизнеспособные клетки визуализируются неокрашенными, так как их клеточная оболочка непроницаема для красителя метиленового синего.

Рис. 18. Структура метиленового синего

В препарате раздавленной капли обычно хорошо различимы прозрачные овальные или округлые клетки дрожжей с ядрами и оболочками, явственно видными в живых клетках. Мертвые клетки, как правило, имеют меньшие размеры по сравнению с живыми, их цитоплазма окрашена в бледно-голубой цвет, волютиновые гранулы (запасной питательный материал в виде комплексов РНК с метаполифосфатами) – в красно-фиолетовый цвет. Для окрашивания ядер нежизнеспособных дрожжевых клеток используют красители сафранин или малахитовый зеленый (рис. 19), внося их аналогично метиленовому синему микробиологической петлей. При этом ядра мертвых дрожжевых клеток прокрашиваются в красный или зеленый цвет соответственно.

Рис. 19. Структуры сафранина (А) и малахитового зеленого (Б)

Препарат живых бактериальных клеток готовят аналогично препарату дрожжевых клеток, но бактерии можно рассматривать и без добавления красителей. На поверхность покровного стекла готового препарата наносят каплю иммерсионного масла, для микроскопии используют иммерсионный объектив 100х. Препарат желательно рассматривать с прикрытой диафрагмой (в затемненном поле). При хорошей жизнеспособности культуры наблюдаются быстрые разнохарактерные движения отдельных бактериальных клеток.

Материалы и оборудование

• Автоматические пипетки объемом до 0,02 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Наконечники объемом до 0,01 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Микробиологические петли одноразовые или многоразовые.

• Спиртовка, этанол 90 %-ный, тампоны ватные.

• Карандаш, ручка, лабораторный журнал.

• Чашка Петри с выросшей культурой трансформантов E. coli (см. Лабораторную работу 13).

• Чашка Петри с выросшей культурой дрожжевых клеток (см. Лабораторную работу 16).

• Предметные и покровные стекла.

• Краситель метиленовый синий по Леффлеру, 30 %-ный водный раствор насыщенного раствора в этаноле.

• Краситель сафранин, 2,5 %-ный раствор в 96 %-ном этаноле.

• Краситель малахитовый зеленый.

• Световой микроскоп с набором объективов 40х–100х.