Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

• Микропробирки стерильные объемом 1,5 мл.

• Шпатель Дригальского.

• Микробиологические петли одноразовые стерильные.

• Пинцеты лабораторные.

• Спиртовка, этанол 90 %-ный.

• Тампоны ватные.

• Карандаш, ручка, лабораторный журнал.

• Культура микроорганизмов – штамм JM-109 E. coli.

Поставленные задачи

Определить титр жизнеспособных клеток в бактериальной культуре чашечным методом Коха.

1. Приготовить серию разведений клеток бактериальной культуры.

2. Высеять клетки из последнего разведения на поверхность плотной среды LB в чашках Петри в двух повторах.

3. Произвести подсчеты количества выросших колоний, определить среднее значение и рассчитать титр жизнеспособных клеток в исходной клеточной культуре.

Ход работы

1. Клеточную культуру штамма JM-109 E. coli, хранящуюся при –80 °C, разморозить при комнатной температуре и поместить в лед.

2. Приготовить серию стократных разведений клеточной суспензии: стерильным наконечником отобрать 10 мкл суспензии размороженных клеток, перенести в микропробирку, содержащую 990 мкл жидкой среды LB, и осторожно перемешать (разведение I). Затем 10 мкл этой суспензии (разбавление в 10² раз) перенести во вторую пробирку, содержащую 990 мкл жидкой среды LB, тем самым достигая разбавления 10⁴ раз (разведение II).

3. В центр чашки Петри с плотной ростовой средой LB, не содержащей антибиотик, нанести 90 мкл жидкой среды LB. В получившуюся каплю внести 10 мкл клеточной суспензии из разведения II (см. п. 2), тем самым достигая разведения 10⁶ раз (разведение III).

4. Повторить п. 3 со второй чашкой Петри.

5. Посеять бактериальные клетки по поверхности плотной среды охлажденным (1–2 мин на воздухе после стерилизации) шпателем Дригальского.

6. Засеянные на чашки культуры бактерий выращивать в течение 16–18 ч при 37 °C.

7. По окончании инкубации чашек подсчитать количество колониеобразующих единиц, выросших после высева бактерий из разведения III, данные (а1 и а2) занести в таблицу. Вычислить среднее количество выросших колоний (а = (а1 + а2)/2), а затем по формуле М = (а × 10n)/V вычислить титр жизнеспособных клеток в культуре, выраженный в к.о.е./мл (клеточной суспензии). Все данные занести в таблицу (табл. 1).

Таблица 1. Определение титра жизнеспособных клеток в бактериальной культуре

Полученные результаты

1. Умение определять титр жизнеспособных бактериальных клеток чашечным методом Коха; составленный протокол.

2. Две чашки Петри с плотной средой LB, засеянной клетками штамма JM-109 E. coli после трех последовательных стократных разведений.

3. Таблица с результатами подсчета выросших колоний и рассчитанное по формуле значение титра жизнеспособных клеток в клеточной культуре.

Вопросы по теме

1. Назовите и опишите фазы ростового цикла периодической клеточной культуры.

2. Назовите и опишите существующие методы подсчета общего количества клеток в клеточной культуре.