Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

• Спиртовка, этанол 90 %-ный, тампоны ватные.

• Карандаш, ручка, лабораторный журнал.

• Чашка Петри с выросшей культурой трансформантов (см. Лабораторную работу 13).

• Пробирка объемом 15 мл с суспензией трансформированных клеток, выращенных на жидкой среде (см. Лабораторную работу 15).

• Стерильная жидкая среда LB.

• Глицерин, 50 %-ный раствор.

• Плотная среда LB, стерилизованная автоклавированием.

• Стерильные микропробирки (криопробирки) объемом 1,5–2,0 мл с завинчивающимися крышками.

• Мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, шприцы объемом 2–5 мл.

Поставленные задачи

1. Приготовить криосток бактериальной культуры трансформированных клеток для хранения методом криоконсервации.

2. Приготовить агаровые столбики для хранения бактериальной культуры трансформированных клеток.

Ход работы

I. Приготовить криосток для консервации трансформированных бактерий.

1. Ночную культуру трансформированных бактерий (1 мл), пересеянных в Лабораторной работе 15 с плотной среды в жидкую среду LB, дополненную ампициллином, перенести в охлажденную стерильную микропробирку.

2. Микропробирку центрифугировать в течение 10 мин при 1000 g.

3. Приготовить 1 мл жидкой среды LB c 10 %-ным глицерином. Для этого простерилизовать раствор 50 %-ного глицерина через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм; рассчитать, сколько нужно добавить стерильного 50 %-ного раствора глицерина к стерильной среде LB; асептически добавить рассчитанное количество глицерина к среде LB.

4. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость удалить, полученный осадок клеток ресуспендировать в 1 мл жидкой среды LB c 10 %-ным глицерином. Перемешать до получения однородной суспензии клеток, затем заморозить в жидком азоте и убрать на хранение в низкотемпературный холодильник (–70 °C или –80 °C).

II. Приготовление агаровых столбиков для хранения бактериальных культур трансформантов.

1. Готовую плотную среду LB разогреть в микроволновой печи, слегка остудить и асептически разлить (по 1–1,2 мл агаризованной среды) в пробирки объемом 1,5–2 мл с завинчивающимися крышками.

2. При помощи микробиологической петли отобрать отдельную колонию с поверхности плотной среды в чашке Петри. При консервации жидкой клеточной культуры смочить петлю в клеточной культуре.

3. Несколько раз погрузить микробиологическую петлю в застывший и охлажденный до комнатной температуры агаровый столбик.

4. Плотно завинтить крышку пробирки; хранить без пересевов от нескольких недель до одного года в темноте при 4–6 °C.

Полученные результаты

1. Криосток для хранения трансформированных бактериальных клеток без ограничения срока, замороженный при –70 °C.

2. Агаровые столбики для хранения трансформированных бактериальных клеток до года при 4 °C.

Вопросы по теме

1. Перечислите основные способы хранения бактериальных культур.

2. Сравните достоинства и недостатки двух на выбор способов хранения, использованных в данной работе.

3. Зачем добавляют ДМСО или глицерин перед замораживанием бактериальных клеток?