Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

3. Что такое титр клеточной культуры?

4. Как определяется количество жизнеспособных клеток в бактериальной культуре?

5. Напишите формулу, по которой подсчитывают титр жизнеспособных клеток в культуре.

6. Каковы характерные особенности клеточной культуры, находящейся в середине экспоненциальной фазы роста?

Лабораторная работа 15. Способы пересева бактериальных колоний трансформантов и плотные среды

Цель работы

Изучить способы пересевов отдельных клонов выросших трансформантов на жидкие и плотные питательные среды. Проанализировать и обсудить результаты трансформации клеток E. coli; обсудить разные способы трансформации.

Введение

Практически в любой биотехнологической или молекулярно-биологической задаче, связанной с использованием бактериальных клеточных культур, необходимо выполнять пересевы (или субкультивирование) с жидкой питательной среды на жидкую или плотную и, наоборот, с плотной на жидкую или плотную. Помимо продления существования уже имеющейся клеточной культуры, при помощи субкультивирования возможно получение новых штаммов, например, продуцентов целевых рекомбинантных белков, однородных популяций бактерий и проч.

Чтобы получить клеточную культуру трансформированных бактерий, необходимо осуществить отбор и пересев одной колонии клеток с чашки Петри, изолированной от соседних колоний. Считается, что такая изолированная колония представляет собой совокупность генетически идентичных потомков одной бактериальной клетки (колониеобразующей единицы). Помимо изолированности, колония должна быть правильной округлой формы (чтобы исключить вероятность слияния двух разных колоний), иметь размер 1–4 мм в диаметре, располагаться максимально удаленно от краев чашки и от соседних колоний и не быть окруженной сателлитными колониями. В зависимости от вида и концентрации применяемого антибиотика на поверхности плотной среды в чашках Петри помимо крупных колоний трансформантов зачастую можно встретить вокруг них россыпь мелких. Это так называемые сателлитные колонии, представляющие собой, как правило, нетрансформированные бактериальные клетки, не несущие ген устойчивости к антибиотику. Их способность вырастать на селективной среде (в присутствии антибиотика) может быть связана с уменьшением концентрации антибиотика в плотной среде.

Единичную колонию, удовлетворяющую приведенным выше критериям, обычно скалывают заранее стерилизованной микробиологической иглой или ребром микробиологической петли и инокулируют в жидкую питательную среду, при необходимости дополненную соответствующим антибиотиком. Если требуется фиксация данной колонии на поверхности плотной среды, этой же петлей проводят (методом истощающего штриха) рассев до единичных клонов по поверхности плотной среды, также дополненной антибиотиком.

Материалы и оборудование

• Автоматические пипетки объемом до 0,02 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Наконечники объемом до 0,01 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Стерильный бокс или ламинарный шкаф.

• Пипетки стерильные различного объема.

• Шпатель Дригальского.

• Микробиологические петли и иглы одноразовые и многоразовые.

• Пинцет лабораторный.

• Спиртовка, этанол 90 %-ный, тампоны ватные.

• Карандаш, ручка, лабораторный журнал.

• Чашка Петри с выросшей культурой трансформантов (см. Лабораторную работу 13).

• Чашка Петри с плотной средой YPD, дополненной ампициллином.

• Чашка Петри с плотной средой LB, дополненной ампициллином.

• Стерильная жидкая среда LB.

• Стерильный раствор ампициллина 1000х, 100 мг/мл.

Поставленные задачи

1. Освоить различные техники пересева отдельных клонов трансформантов на жидкую и плотную селективные среды – рассев до единичных клонов, скалывание, соскоб.

2. Выполнить рисунок по поверхности плотной селективной среды LB в чашке Петри бактериальными клетками, трансформированными плазмидными векторами с разными генами флуоресцентных белков.

Ход работы