Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

• Среда LB жидкая стерилизованная.

• Стерильный бокс или ламинарный шкаф.

• Центрифуга для микропробирок.

• Термостатический инкубатор (с функцией шейкера) для выращивания микроорганизмов на жидких и плотных средах.

• Твердотельный термостат или водяная баня с градусником.

• Пипетки стерильные различного объема.

• Автоматические пипетки объемом до 0,02 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Наконечники для автоматических пипеток объемом до 0,01 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Шпатель Дригальского.

• Микробиологические петли.

• Спиртовка, ватные тампоны.

• Лед, емкости для льда.

Поставленные задачи

1. Осуществить трансформацию компетентных клеток штамма JM-109 E. coli плазмидным вектором pQE-30 (Qiagen, США), содержащим ген флуоресцентного белка – один на выбор студента из коллекции векторов (см. Приложение, табл. 2). Вектор pQE-30 содержит гены резистентности к антибиотикам ампициллину (AmpR) и хлорамфениколу (CmR).

2. Посеять трансформированные бактериальные культуры на плотную среду LB, дополненную селективным маркером – антибиотиком ампициллином.

Ход работы

Действия, описанные в пп. 1, 2, 6, 7, выполнить в стерильном боксе или ламинарном шкафу.

1. Компетентные клетки (50–100 мкл) штамма JM-109 E. coli, хранящиеся при –80◦С, разморозить при комнатной температуре, затем поместить в лед.

2. К размороженным клеткам добавить охлажденный препарат ДНК (10–100 нг в объеме 1–10 мкл), осторожно размешать*, вращая микропробирку между ладонями.

*Обработанные хлоридом кальция компетентные клетки отличаются более рыхлой и менее прочной внешней мембраной, поэтому при работе с ними нужно избегать резкого механического встряхивания.

3. Трансформационную смесь инкубировать во льду в течение 15–30 мин.

4. Провести тепловой шок (при 42 °C в течение 90 с), поставив микропробирки с трансформационной смесью в твердотельный термостат или на водяную баню.

5. По окончании теплового шока микропробирки быстро охладить во льду и инкубировать во льду в течение 3–5 мин.

6. По окончании инкубации добавить к трансформационной смеси 200 мкл стерильной среды LB без антибиотика и поместить в инкубатор-шейкер с умеренным встряхиванием (200 об/мин) при 37 °C на 30–40 мин.

7. Высеять трансформационную смесь* на плотную среду LB, содержащую селективный маркер ампициллин (конечная концентрация 100–120 мкг/мл). Для этого автоматической пипеткой суспензию клеток перенести в центр чашки Петри с плотной средой и равномерно распределить по поверхности шпателем Дригальского. На дне чашки записать дату эксперимента, названия ростовой среды, клеточной культуры, тип вектора и гена белка, содержащегося в векторе.

*Перед высевом рекомендуется центрифугирование при 1000 g в течение 3–4 мин с последующим отбором 150–200 мкл надосадочной жидкости. Рыхлый осадок бактериальных клеток осторожно ресуспендировать в оставшихся 100 мкл жидкости и высеять на плотную среду в чашке Петри весь объем.

8. Засеянные на плотную среду трансформированные культуры бактерий выращивать в течение 16–18 ч при 37 °C.

Полученные результаты

1. Протоколы трансформации бактериальных клеток стандартным плазмидным вектором, содержащим ген рекомбинантного белка.

2. Трансформация компетентных клеток штамма JM-109 E. coli плазмидным вектором pQE-30, содержащим ген флуоресцентного белка (см. илл. 7А).