Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

7. Засеянную на плотную среду культуру бактерий выращивать в течение 16–18 ч при 37 °C.

Полученные результаты

1. Протокол пересева бактериальных клеток из чистой культуры с использованием нескольких техник посева штрихом и шпателем Дригальского.

2. Чашка Петри с плотной средой LB, засеянной клетками чистой культуры штамма JM-109 E. coli методом истощающего штриха.

3. Рисунок схем других возможных штрихов, выполняемых по плотной среде на чашке Петри при посеве культур микроорганизмов.

Вопросы по теме

1. Назовите и опишите основные способы рассева культур микроорганизмов на плотные среды.

2. Что называется инокуляцией и инокулюмом?

3. Для чего используется техника истощающего штриха?

4. Почему при выращивании клеточных культур на плотных ростовых средах чашки Петри инкубируют крышкой вниз?

5. Как различаются условия инкубирования бактериальных и дрожжевых клеток на плотных средах?

Лабораторная работа 13. Трансформация компетентных бактериальных клеток E. coli плазмидной ДНК, содержащей гены флуоресцентных белков

Цель работы

Освоить метод трансформации готовых компетентных клеток E. coli штамма JM-109 плазмидными векторами (с использованием коллекции векторов pQE-30, содержащих гены флуоресцентных белков).

Введение

Трансформация – это процесс поглощения бактериальной клеткой чужеродной ДНК из внешней среды (экзогенной ДНК), в ходе которого молекула ДНК транслоцируется через клеточную стенку бактерии. Очевидно, что эффективность этого процесса в высокой степени зависит как от свойств и строения (состояния) клеточной стенки бактерии, так и от свойств и строения молекулы ДНК. Ниже будут рассмотрены вопросы, касающиеся взаимосвязи свойств клеточной стенки бактерии и ее способности поглощать нуклеиновую кислоту из окружающей среды.

Бактериальные клетки, способные к трансформации экзогенными молекулами ДНК, называются компетентными. Компетентность как физиологическое состояние играет ключевую роль на начальных этапах проникновения молекулы ДНК в клетку, когда осуществляется адсорбция ДНК на поверхности клеточной стенки, а также последующая транслокация молекулы ДНК через липидный бислой. В зависимости от особенностей строения клеточной стенки некоторые – далеко не все – виды бактерий в своем обычном состоянии способны к поглощению молекул ДНК, т. е. обладают естественной компетенцией. Если поглощение молекул ДНК клеткой становится возможным только после специфической обработки, направленной на увеличение проницаемости клеточной стенки, то такую компетентность называют индуцированной. В общем случае на способность бактериальной клетки к поглощению экзогенной ДНК (главным образом на состояние клеточной стенки) могут оказывать влияние внешние факторы: состав, рН окружающей (реакционной) среды, температура и т. п.

Бактерии E. сoli, относящиеся к грамотрицательным, характеризуются наличием внешней и внутренней мембраны (рис. 13 А, Б). Так как внешняя мембрана E. coli непроницаема для экзогенных молекул ДНК, естественная компетентность у клеток E. coli отсутствует. В зависимости от способа воздействия на клеточную стенку методы формирования индуцированной компетентности классифицируют следующим образом: химические, физические и ферментативные.

Исторически самым первым был разработан ферментативный метод получения компетентных клеток E. coli, основанный на частичном гидролизе клеточной стенки под действием ферментов, как правило, лизоцима (см. [Щелкунов, 2004]). Однако ввиду того что активность ферментов сложно контролировать и, следовательно, данный метод в целом плохо воспроизводим, он начал выходить из употребления около 50 лет назад – с развитием химических методов обработки клеточной стенки.

Наиболее эффективным химическим методом получения компетентных клеток является способ, основанный на обработке клеток раствором CaCl2,или Ca2+-зависимая трансформация клеток E. coli. Он был разработан несколько десятков лет назад, и его многочисленные разновидности успешно применяются в лабораторной практике до сих пор. К гипотетическим эффектам от обработки клеток ионами Ca2+ относят и возможную нейтрализацию отрицательных зарядов на поверхности клеток, и денатурацию либо, наоборот, активацию белков, интегрированных в мембрану клетки, и влияние на конфигурацию липидного бислоя. Все эти эффекты сопряжены с увеличением проницаемости клеточной мембраны и в конечном итоге способствуют более эффективному поглощению экзогенной ДНК.

Рис. 13. А – общий вид бактерии E. coli; Б – строение мембраны E. coli; В – структура липидного бислоя внешней мембраны при фазовом переходе из геля в жидкокристаллическое состояние под действием изменения температуры и в присутствии ионов Ca2+

На компетентность бактериальной клетки могут влиять различные факторы внешней среды, в том числе температура. Увеличение температуры приводит к индукции в липидных мембранах обратимого фазового перехода гель – жидкий кристалл (рис. 13В), для которого характерно изменение конфигурации бислоя липидов из обычной двухслойной в гексагональную. При этом липидный бислой разрыхляется, изменяются его геометрические характеристики – толщина, расстояние между соседними липидными молекулами и проч., что в конечном итоге способствует резкому увеличению проницаемости клеточной стенки.

Для индукции фазового перехода в лабораторных условиях трансформационную смесь компетентных клеток и ДНК подвергают тепловому шоку – кратковременному нагреву с 0 °C до 42 °C. При таком нагреве транслокация ДНК через клеточную стенку осуществляется в течение не более ~20 с. Необходимо отметить, что большинство методик трансформации предлагают проведение теплового шока в течение 45–90 с для достижения равномерного прогрева всего объема трансформационной смеси. При последующем охлаждении с 42 °C до 0 °C в ходе обратного фазового перехода липидов из жидкого кристалла в гель клеточная стенка вновь становится проницаемой для молекул ДНК, причем на более продолжительный период, чем при нагревании. Описанные выше процессы фазовых переходов характерны исключительно для липидов внешней мембраны. Необходимо отметить, что цитоплазматическая (внутренняя) мембрана бактериальных клеток практически не подвержена изменению конфигурации при нагреве/охлаждении и всегда хорошо проницаема для молекул ДНК. В целом молекулярные механизмы транслокации плазмидной ДНК через цитоплазматическую мембрану клеток E. coli изучены к настоящему времени далеко не полностью.

Эффективностью трансформации называют отношение числа выросших на плотной среде в чашке Петри колоний, представляющих собой совокупность генетически идентичных потомков одной трансформированной клетки (колониеобразующей единицы, к.о. е) к единице массы стандартной ДНК, добавляемой для трансформации в ненасыщающих количествах (см. [Гловер, 1988]). Эффективность трансформации измеряется в к.о.е./мкг ДНК и поддается определению путем подсчета выросших на трансформационной чашке колоний и дальнейших несложных вычислений. Считается, что наибольшая эффективность трансформации составляет 108–109 к.о.е./мкг ДНК; при использовании классического метода с обработкой клеток ионами Ca2+ эффективность трансформации может доходить до 105–106 к.о.е./мкг ДНК. Более современные методы трансформации бактериальных клеток, в которых наряду с ионами Ca2+ применяются такие реактивы, как диметилсульфоксид (ДМСО), дитиотреитол (ДТТ), полиэтиленгликоль (ПЭГ), обеспечивают 1–10х107 к.о.е./мкг ДНК для разных бактериальных штаммов, что дает возможность работать с небольшими количествами ДНК.

Существуют также физические методы трансформации, позволяющие добиваться максимально высоких показателей эффективности трансформации. Наиболее известный из этих методов – электропорация – основан на кратковременном (до 10 с) воздействии на клетки электрического поля высокой напряженности (1–15 кВ/см). В результате в бислойной липидной мембране клетки происходит обратимое порообразование, или, иначе, электропробой, за счет чего молекулы ДНК проникают в клетку.

Материалы и оборудование

• Готовые компетентные клетки штамма JM-109 E. coli, замороженные при –80◦С.

• Коллекция плазмидных векторов pQE-30, содержащих гены флуоресцентных белков.

• Чашка Петри с плотной средой с антибиотиком ампициллином (100–120 мкг/мл).