Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Отобрать пробы из клеточной суспензии можно также при помощи стерильного наконечника автоматической пипетки или стерильной одноразовой пипетки с дозатором. В зависимости от задачи либо отобранный образец наносят в центр чашки Петри, либо, чтобы уменьшить количество высеваемых клеток и вырастить на чашке изолированные колонии, делают серию разбавлений и высевают клетки из последнего, так же нанося посевной материал в центр чашки Петри. Рассев культуры по поверхности плотной среды в этом случае осуществляют шпателем Дригальского, совершая им круговые движения или вращая чашку. При этом достигается равномерное распределение клеток по всей поверхности плотной ростовой среды (рис. 12).

Засеянные культурами клеток чашки Петри герметизируют пленкой Parafilm и инкубируют в термостате, перевернув чашки слоем агаризованной среды вверх, чтобы конденсирующаяся вода скапливалась на крышке чашки и не размывала изолированные колонии. При выращивании клеточных культур в термостате поддерживается оптимальная температура, наиболее подходящая для роста того или иного вида микроорганизмов. Так, бактериальные клетки E. coli выращивают в термостате при 37 °C от 16–18 до 20–22 ч в зависимости от штамма, а дрожжевые клетки – при 30 °C в течение 36–48 ч.

Рис. 12. Посев культуры микроорганизмов на поверхность плотной среды при помощи шпателя Дригальского: А – шпатель Дригальского; Б – рост микроорганизмов после рассева в зависимости от количества посевного материала (после серии разбавлений)

По окончании инкубации оценивают результаты посева; в зависимости от поставленной задачи делают необходимые пересевы – для размножения культуры, изучения морфологии и т. п., а чашку Петри вновь герметизируют пленкой Parafilm и помещают на хранение в холодильник при 4 °C.

Материалы и оборудование

• Автоматические пипетки объемом до 0,02 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Наконечники для автоматических пипеток объемом до 0,01 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Стерильный бокс или ламинарный шкаф.

• Пипетки стерильные различного объема.

• Чашка Петри с плотной средой LB без добавления антибиотика.

• Шпатель Дригальского.

• Микробиологические петли одноразовые и многоразовые.

• Пинцеты лабораторные.

• Спиртовка.

• Этанол 90 %-ный.

• Тампоны ватные.

• Карандаш, ручка, лабораторный журнал.

• Культура бактериальных клеток – музейный штамм JM-109 E. coli.

Поставленные задачи

1. Ознакомиться с методами работы в стерильных условиях при ведении бактериальных культур.

2. Освоить различные техники посева клеток бактериальной культуры по поверхности неселективной плотной среды LB.

Ход работы

1. Клеточные культуры штамма JM-109 E. coli, хранящиеся при –80 °C, разморозить при комнатной температуре и поместить в лед.

2. Перед высевом бактериальных клеток на плотную LB среду шпателем Дригальского разбавить клеточную культуру жидкой средой LB. Для этого стерильным наконечником отобрать 10 мкл суспензии размороженных клеток и перенести в микропробирку, содержащую 90 мкл жидкой среды LB, после чего осторожно перемешать.

3. Шпатель Дригальского простерилизовать в пламени горелки, предварительно погрузив в 90–96 %-ный этанол.

4. В центр ранее приготовленной чашки Петри с плотной ростовой средой LB, не содержащей антибиотик, нанести 90 мкл жидкой среды LB. В получившуюся каплю внести 10 мкл клеточной суспензии (см. п. 2).

5. Посеять бактериальные клетки по поверхности плотной среды в чашке Петри охлажденным (1–2 мин на воздухе после стерилизации) шпателем Дригальского: либо круговыми движениями шпателя по поверхности плотной среды, при этом чашка со средой, стоящая неподвижно, придерживается левой рукой; либо поступательными движениями шпателя по поверхности среды, при этом чашка Петри со средой вращается левой рукой*.

*Вращение чашки позволяет достичь максимально равномерного распределения клеток по поверхности плотной среды.

6. Посеять клетки E. coli методом истощающего штриха на поверхность плотной среды LB в новой чашке Петри: стерильную микробиологическую петлю кратковременно погрузить в микропробирку с размороженной суспензией клеток бактерий E. coli, затем рассеять клетки по поверхности плотной среды по схеме, приведенной на рис. 12Б.