Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

4. Рассчитать (без учета разбавления) объемы концентрированных растворов антибиотиков, которые необходимо добавить в среду для получения конечной концентрации: ампициллина – 100 мкг/мл; канамицина – 50 мкг/мл; хлорамфеникола – 50 мкг/мл.

5. По окончании стерилизации ростовую среду охладить не менее чем до 55 °C (приблизительно это температура, при которой возможно безболезненно держать колбу в руке). Во время охлаждения среды подготовить к заливке чашки Петри – на дне чашек надписать водостойким маркером дату заливки, название среды, название и концентрацию (при наличии) антибиотика, инициалы выполняющего работу. Надпись следует размещать вдоль края чашки, чтобы она не мешала наблюдать выросшие колонии.

6. Измерить температуру электронным градусником с простерилизованным наконечником*, затем разлить среду по чашкам Петри (на каждую чашку – не менее 20 мл плотной среды). Вначале залить в чашки среды без добавления антибиотика (неселективные среды LB и YPD). Для приготовления селективных плотных YPD сред аликвоты, необходимые для заливки одной чашки (20–25 мл), перенести в две стерильные пробирки объемом 50 мл, в одну добавить канамицин до 50 мкг/мл, во вторую – хлорамфеникол до 50 мкг/мл, хорошо перемешать и залить в чашки Петри. В оставшуюся среду добавить рассчитанный объем ампициллина (до 100 мкг/мл), хорошо перемешать и залить в чашку. Для приготовления селективной плотной LB среды добавить рассчитанный объем ампициллина (до 100 мкг/мл), хорошо перемешать и залить равными частями в три чашки Петри.

*Упрощенная оценка достаточного остывания среды – когда колба по ощущению горячая, но ее уже можно держать за часть с горячей средой.

7. Чашки с приоткрытой крышкой оставить в стерильном боксе или в ламинаре до полного застывания и охлаждения плотной среды (10–15 мин), затем по возможности подсушить чашки для удаления с поверхности плотной среды излишков влаги.

8. После застывания плотной среды закрыть чашки Петри крышками и загерметизировать крышки пленкой Parafilm, после чего поместить на хранение в холодильник (4 °C) крышками вниз.

Полученные результаты

1. Протоколы приготовления жидкой и плотной питательных бактериальных сред LB и YPD и умение готовить эти среды.

2. Протокол приготовления и стерилизации концентрированных растворов антибиотиков, умение приготовить и рассчитать требуемый объем такого раствора для создания целевой конечной концентрации в ростовой среде.

3. Приготовленные ростовые среды: LB жидкая – 50 мл на группу из 2–3 студентов и плотные среды LB и YPD, залитые в 9 чашек Петри (на каждого студента):

1) три чашки с неселективной средой LB, две чашки со средой LB, содержащей ампициллин;

2) по одной чашке с плотной средой YPD с канамицином, хлорамфениколом, ампициллином и одна чашка с неселективной YPD средой.

Вопросы по теме

1. Дайте определение питательной ростовой среды.

2. Какие требования предъявляются к ростовым средам?

3. Какие компоненты содержатся в минимальных ростовых средах?

4. Что представляют собой сложные препараты для получения обогащенных ростовых сред?

5. Что такое селективная и неселективная ростовые среды?

6. Почему концентрированные растворы антибиотиков добавляют в среду с температурой не выше 55 °C?

Лабораторная работа 12. Культивирование микроорганизмов на питательных средах на примере E. coli; различные способы посева бактериальных клеток

Цель работы

Освоить способы посева клеток микроорганизмов на плотные ростовые среды, а также приемы культивирования чистых культур микроорганизмов на примере E. coli.

Введение

Выполнение экспериментальной задачи с использованием клеточных культур бактерий или дрожжей, как правило, начинается с посева клеток чистого штамма, хранящихся тем или иным способом. Такая культура состоит из клеток одного вида и может многократно служить источником для посева и дальнейшего субкультивирования. В общем случае посевом или инокуляцией называется внесение клеток (инокулюма) из клеточной культуры в стерильную среду.

Для проведения успешного эксперимента инокуляция должна проводиться в строгих асептических условиях с использованием соответствующего оборудования – ламинарно-потокового шкафа (подробнее об асептических условиях и об устройстве ламинарного шкафа см. введение к Лабораторной работе 1). Работа в таких условиях предотвращает случайное попадание в ростовые среды клеток посторонних микроорганизмов из окружающего пространства и, следовательно, поддерживает видовую однородность выращиваемой клеточной культуры.

Посев клеток чистого штамма для получения изолированных колоний осуществляют на поверхность плотных сред, залитых в чашки Петри. Существует два основных способа – рассев микробиологической петлей или шпателем Дригальского; подробнее о других методах рассева штаммов микроорганизмов (см. [Грицкевич, 2017]). Микробиологическая петля представляет собой тонкую проволоку, как правило, из вольфрама, изогнутую на одном конце в виде петли, а вторым концом закрепленную в металлическом или пластиковом держателе. Диаметр микробиологической петли для рутинных работ составляет 4–5 мм, в специальных случаях могут понадобиться петли большего или меньшего диаметра. В зависимости от размера петли ею можно отобрать различные объемы клеточной суспензии. В настоящее время применяются также пластиковые одноразовые стерильные петли объемом 1–10 мкл, которые не требуют дополнительной стерилизации.

Перед отбором посевного материала для инокуляции микробиологическую петлю стерилизуют прокаливанием в пламени горелки, или фламбированием (это относится исключительно к многоразовым металлическим петлям). Для этого петлю вносят в верхнюю наиболее высокотемпературную часть пламени, накаливают докрасна и, перемещая петлю, прокаливают прилегающую к петле часть проволоки. После чего петлю охлаждают либо на воздухе в течение нескольких минут, либо прикасаясь к внутренней поверхности микробиологической посуды (стеклянной) или к поверхности питательной среды. После охлаждения осуществляют отбор клеточной культуры для последующего посева (рис. 11А).

Рис. 11. Посев культуры микроорганизмов на поверхность плотной среды при помощи микробиологической петли методом истощающего штриха: А – последовательность действий при отборе посевного материала; Б – схема рассева

Посев отобранных микробиологической петлей клеток по поверхности плотной среды осуществляют методом истощающего штриха, проводя штрихи разной формы, например, как показано на рис. 11Б. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в пламени горелки.