Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

• Пипетки стерильные различного объема.

• Пробирки пластиковые стерильные объемом 50 мл.

• Микропробирки стерильные объемом 1,5 мл.

• Чашки Петри стерильные одноразовые.

• Пинцеты лабораторные.

• Спиртовка, этанол 90 %-ный.

• Тампоны ватные.

• Карандаш, ручка, лабораторный журнал.

• Антибиотики: ампициллина натриевая соль, канамицин, хлорамфеникол.

• Компоненты для сред LB и YPD жидкой и плотной: бакто-триптон, дрожжевой экстракт, агар, хлорид натрия, D-глюкоза.

• Мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, шприцы объемом 2–5 мл.

• Вода дистиллированная.

Состав готовящихся в ходе работы растворов и сред

1. Среда LB жидкая (на 1 л: 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl). Стерилизуют автоклавированием.

2. Среда LB плотная (на 1 л: 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 1,5 %-ного (вес/объем) агара). Стерилизуют автоклавированием.

3. Среда YPD жидкая (на 1 л: 3 г дрожжевого экстракта, 10 г бакто-пептона, 10 г декстрозы (D-глюкозы)). Стерилизуют автоклавированием*.

4. Среда YPD плотная (на 1 л: 3 г дрожжевого экстракта, 10 г бакто-пептона, 10 г декстрозы (D-глюкозы), 1,5 %-ного (вес/объем) агара). Стерилизуют автоклавированием*.

*Поскольку данные среды содержат термолабильный компонент – глюкозу, рекомендуется автоклавирование при 110–112 °C либо, если это возможно, добавление в готовую охлажденную среду концентрированного раствора глюкозы (10х), стерилизованного через мембранный фильтр.

5. Ампициллина натриевая соль, концентрат (сток) – водный раствор 1000x – 100 мг/мл, канамицин – водный раствор 500х – 25 мг/мл, хлорамфеникол – спиртовой раствор 1000х – 50 мг/мл. Растворы ампициллина и канамицина стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Поставленные задачи

1. Ознакомиться с составом, принципами и методами приготовления и стерилизации питательных сред, их компонентов (при необходимости) и растворов антибиотиков.

2. Приготовить жидкую и плотную ростовые среды LB и YPD, стерилизовать при помощи автоклавирования (автоклав включает и выключает преподаватель).

3. Приготовить концентрированные (стоковые) растворы антибиотиков ампициллина (100 мг/мл), канамицина (25 мг/мл) и хлорамфеникола (50 мг/мл), простерилизовать фильтрованием через стерильный мембранный фильтр-насадку на шприц растворы ампициллина и канамицина.

4. Плотные среды LB с добавлением ампициллина и YPD с добавлением ампициллина, канамицина и хлорамфеникола (селективные среды), а также плотные среды LB и YPD без добавления антибиотиков (неселективные среды) залить в чашки Петри.

Ход работы

1. Рассчитать количество сухих компонентов для приготовления 50 мл жидкой и 250 мл плотной среды LB, а также 200 мл плотной среды YPD – см. выше раздел «Cостав готовящихся в ходе работы растворов и сред»*. Взвесить на лабораторных весах навески, растворить** в дистиллированной воде.

*Пункты 1–3 выполнять группами (в п. 1 приведены объемы для двух студентов, в п. 3 – для 3–4 студентов), остальные пункты – индивидуально.

**Все компоненты, за исключением агара, растворить в дистиллированной воде на магнитной мешалке и перенести в бутыли для стерилизации. Навеску нерастворимого при комнатной температуре агара добавить непосредственно в бутыли для стерилизации с готовой жидкой средой LB или YPD.

2. Поместить в автоклав бутыли с приоткрытой на пол-оборота крышкой, простерилизовать ростовые среды автоклавированием при 121 °C в течение 20 мин.

3. Для получения концентрированных растворов (стоков) антибиотиков взвесить 0,4 г ампициллина, 0,1 г канамицина и 0,2 г хлорамфеникола. Рассчитать необходимый объем дистиллированной воды или 96 %-ного этанола (для растворения хлорамфеникола) и растворить навески. Готовые растворы простерилизовать при помощи мембранных фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Стерильные растворы расфасовать в стерильные микропробирки объемом 1,5 мл, после окончания работы хранить при –18 °C.