Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

1. Дайте определение клеточных процессов митоза и апоптоза.

2. Назовите основные фазы митотического деления клетки.

3. Назовите характерные морфологические признаки каждой фазы митоза, визуализируемые при помощи световой микроскопии.

4. Назовите характерные морфологические признаки стадий апоптоза, визуализируемые при помощи световой микроскопии.

III. Методы работы с клеточными культурами микроорганизмов – бактерий и дрожжей

Лабораторная работа 11. Основные принципы работы с бактериальными (Escherihia coli) и дрожжевыми (S. cerevisiae) культурами клеток: приготовление ростовых питательных сред, методы стерилизации, работа в стерильных условиях

Цель работы

Освоить базовые навыки работы с бактериальными и дрожжевыми клетками. Изучить методы приготовления и стерилизации плотных и жидких питательных сред, а также растворов антибиотиков для выращивания культур бактериальных и дрожжевых клеток.

Введение

Питательной, или ростовой, средой в общем случае называют растворы, которые используются для культивирования клеток как прокариотических микроорганизмов – бактерий, так и эукариотических клеток разной видовой принадлежности – от дрожжевых до человеческих. В зависимости от вида и свойств культивируемых клеток, а также цели и масштабов (лабораторное или промышленное) выращивания клеточной культуры состав питательных сред может варьироваться в широком диапазоне. Далее рассматриваются основные свойства и характеристики питательных сред для выращивания бактериальных и дрожжевых клеточных культур, приводятся классификации ростовых сред.

Главная функция ростовой среды заключается в создании подходящих условий для клеток. Основные требования к питательным средам: наличие питательных веществ, солей и иногда сигнальных молекул, необходимых для роста и размножения бактериальных или дрожжевых клеток; поддержание оптимального рН и окислительно-восстановительного потенциала среды; стерильность для исключения контаминации культивируемой культуры посторонними микроорганизмами; кроме того, среда должна быть изотонической для многих микроорганизмов (см.: [Самыгин и др., 2016]).

По содержанию питательных веществ ростовые среды можно разделить на бедные, содержащие необходимый минимум простых питательных веществ (минеральные соли и источники углерода и азота) для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов, и обогащенные питательными веществами, имеющие сложный, иногда неопределенный состав. Культивирование микроорганизмов в зависимости от поставленной задачи может осуществляться как на бедных, так и на обогащенных средах. Многие виды бактерий, в том числе клетки рассматриваемой в настоящем практикуме кишечной палочки Escherihia coli (E. coli), способны к росту на простой среде, содержащей глюкозу и тиамин-хлорид в качестве источников соответственно углерода и азота и неорганические соли (как правило, фосфаты, хлориды, сульфаты натрия, калия, магния, кальция). Такая среда в ее различных вариантах называется минимальной, при этом точная концентрация всех компонентов в ней известна. В случае культивирования бактерий, жизнедеятельность которых обеспечивается за счет органических соединений, для приготовления сред используют сложные компоненты – питательные смеси, основанные на природных источниках с вариабельным составом (например, дрожжевые экстракты, мясные бульоны и т. п.). Биотехнологические задачи нередко требуют выращивания на обогащенных средах даже микроорганизмов, способных расти на минимальных средах (см.: [Глик, Пастернак, 2002]); за счет этого достигаются высокая скорость роста, большая плотность клеточной культуры и т. п.

Для получения обогащенных ростовых сред используют препараты, представляющие собой продукты неполного ферментативного гидролиза белков, – бактопептоны (гидролиз пепсином) и бактотриптоны (гидролиз трипсином). Состав таких препаратов непостоянен и зависит от множества факторов – исходного сырья (мясные, хрящевые и костные ткани животных и рыб, казеин и т. п.), способов приготовления и последующей очистки. В них входят пептиды различной длины, индивидуальные аминокислоты и некоторое количество крупных полипептидов. Вторым наиболее широко используемым видом препаратов – источников сложных питательных веществ – являются дрожжевые экстракты. Они также представляют собой продукты частичного гидролиза – под действием внешних или собственных (автолиз) ферментов и/или нагревания – содержимого дрожжевых клеток. В результате образуется смесь пептидов, полипептидов и аминокислот, а также нуклеотидов, липидов и прочих компонентов клетки. Таким образом, данные препараты служат для микроорганизмов источником как азота и углерода в легкоусваиваемой форме, так и остальных химических элементов. Как правило, после гидролиза полученная масса лиофильно высушивается до состояния беловатого или желтоватого порошка, хорошо растворимого в воде.

По физическому состоянию ростовые питательные среды классифицируют на жидкие и плотные (гелеобразные). Для получения плотной среды в приготовленную одноименную жидкую среду добавляют компонент, способный образовывать гель: агар (смесь полисахаридов) из красных морских водорослей, желатин и т. п. Эти компоненты представляют собой порошки, растворимые только при нагревании. Например, агар плавится в ходе стерилизации ростовых сред путем автоклавирования. При последующем охлаждении ниже 45 °C в плотных средах начинаются процессы формирования структуры геля (в случае агара гель начинает формироваться в диапазоне 40–42 °C). При повторном нагревании плотных сред выше 85 °C происходит обратный переход гель – жидкость.

Селективные среды предназначены для отбора микроорганизмов, в том числе бактерий, по специфическим метаболическим признакам. Чаще всего это способность синтезировать отсутствующий компонент среды или его аналог-заменитель. Кроме того, таким признаком может быть способность нейтрализовать/противодействовать добавленному в среду токсиканту. Так, отбор бактериальных клеток, способных синтезировать ту или иную аминокислоту, возможен на ростовой среде, дефицитной по этой аминокислоте. Селективные среды могут использоваться для выделения определенных типов микроорганизмов из смесей (например, по целлюлазной активности на среде с карбоксиметилцеллюлозой), а также широко применяются в генно-инженерных и биотехнологических задачах для селекции клеток по наличию в них гена, благоприятствующего росту, например, на среде с тем или иным антибиотиком.

Неселективными называются среды, не содержащие какого-либо специфического компонента для отбора определенного вида/типа клеток, на таких средах способны вырастать смеси культур разных видов микроорганизмов.

Питательные среды в обязательном порядке должны быть простерилизованы. Наиболее распространенным способом стерилизации является автоклавирование в течение 20–40 мин при 121 °C. Помимо питательных сред перед началом эксперимента стерилизуют все принадлежности, инструменты, микробиологическую посуду, в которой планируется культивировать клеточную линию. Стеклянную посуду, как правило, стерилизуют в сухожаровом шкафу в течение 2–3 ч при 180 °C или автоклавированием в течение 15–30 мин при 121 °C. В настоящее время часто используют также стерильную одноразовую или многоразовую пластиковую посуду (например, ростовые колбы разного объема), которую можно стерилизовать автоклавированием при 121 °C.

Необходимо отметить, что некоторые компоненты сред обладают значительной термолабильностью и деградируют при высоких температурах. Такие компоненты – к ним относятся неорганические соли: фосфаты, сульфаты, соли магния и кальция, а также практически все антибиотики – стерилизуют отдельно и стерильно добавляют в охлажденную после автоклавирования среду. Например, температура деградации антибиотика ампициллина – ~62 °C, по этой причине его стерильный раствор добавляют в среды с температурой ниже 60 °C (оптимально – начиная с 55 °C). Растворы термолабильных компонентов стерилизуют фильтрацией, например, пропуская через стерильную мембранную фильтр-насадку на шприц (до нескольких десятков миллилитров) или воронку с фильтром. В обоих случаях раствор проходит через фильтр (мембрану) с диаметром пор 0,22 мкм. Поскольку линейные размеры бактериальных клеток превышают размер пор, такие фильтры не пропускают бактерии, за счет чего достигается стерилизация растворов.

В настоящем практикуме рассматриваются методы приготовления жидкой и плотных сред LB (Lysogeny Broth, лизогенная среда) и YPD (Yeast, дрожжевой экстракт, Peptone, бакто-пептон, и Dextrose, D-глюкоза). Рутинное культивирование бактериальных клеток E. coli, как правило, осуществляется на стандартной ростовой среде LB, в состав которой входят бакто-триптон, дрожжевой экстракт и хлорид натрия. Рутинное культивирование дрожжевых клеток S. cerevisiae производится на средах YPD. Необходимо отметить, что бактериальные культуры E. coli способны к росту на дрожжевых питательных средах, в то время как дрожжевая культура S. сerevisiae на бактериальных средах практически не вырастает.

Работа с бактериальными культурами должна проводиться в стерильных условиях. Это необходимо не только для сохранения чистоты культуры, но и для предотвращения загрязнения окружающей среды потенциально опасными микроорганизмами. Методы и приемы стерилизации, а также специальные устройства, используемые при культивировании эукариотических клеток, применяются и при работе с бактериальными культурами. Помимо этого, все необходимые многоразовые инструменты до и после использования должны стерилизоваться прокаливанием в пламени горелки. Для предотвращения как контаминации бактериальной культуры, так и нежелательного распространения бактерий все рабочие поверхности необходимо обрабатывать дезраствором с последующим применением ультрафиолетового облучения до и после работы. Контаминированные отходы и посуду дезактивируют химически или автоклавированием.

Из-за высоких требований стерильности в клеточном блоке запрещен прием пищи и напитков.

Материалы и оборудование

• Автоматические пипетки объемом до 0,02 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Наконечники для автоматических пипеток объемом до 0,01 мл, 0,2 мл, 1,0 мл.

• Cтерильный блок или ламинарный шкаф.

• Весы лабораторные, шпатели и емкости для взвешивания.

• Градусник электронный с металлическим (стерилизуемым) датчиком.

• Мешалки магнитные с набором магнитных якорей.

• Автоклав.

• Стеклянные бутыли с завинчивающейся крышкой (типа Simax, Wheaton) объемом 50 мл, 250 мл.