Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

VII. Наблюдать за состоянием клеток в планшете в течение 1–4 дней (по возможности). Отметить лунки, цвет среды в которых стал изменяться (желтеть).

VIII. На 2-й, или 3-й, или 5-й день (в зависимости от темпов роста выбранной клеточной линии; определяется преподавателем) оценить количество клеток.

1. Подсчитать количество лунок с изменившимся цветом ростовой среды и провести исследование методом Аlamar Blue.

2. Добавить к клеткам по 10 мкл рабочего раствора Аlamar Blue. Инкубировать 2 ч.

3. Жизнеспособность клеток в данном исследовании оценивается по их флуоресценции при экстинкции 560 нм и эмиссии 590 нм на флуориметре. Дополнительно оценить визуально изменение цвета при различных концентрациях препарата в планшете (см. илл. 6).

4. Рассчитать по возможности концентрацию препарата, при котором на момент измерения погибли половина клеток.

Полученные результаты

Протокол определения цитотоксичности препаратов с детекцией Alamar Blue.

Вопросы по теме

1. Что такое кондиционированная среда?

2. Как на практике повышают выживаемость клеток при малой плотности посева?

3. Какие методы определения цитотоксичности чаще всего используются в лабораторных экспериментах?

Лабораторная работа 6. Изучение подвижности клеток методом «затягивания рубца», он же «скретч-тест»

Цель работы

Освоить методику оценки подвижности адгезионных клеток и оценить скорость зарастания царапины в культуре клеток.

Введение

Метод «затягивания рубца» используется для изучения межклеточного взаимодействия и миграции адгезионных клеток. Он основан на наблюдении за миграцией клеток в бесклеточную зону и зарастании царапины в слое клеток. Этот простой метод полуколичественного измерения миграции клеток в слое можно легко адаптировать к различным экспериментальным условиям. К недостаткам теста относится непостоянство размеров и формы царапины, а также возможное повреждение прилегающих к царапине клеток при ее создании, что может влиять на полученные результаты. Существуют альтернативные методы: например, в планшет перед посадкой клеток устанавливаются специальные вставки, которые касаются дна лунок и закрывают часть культуральной поверхности. В результате после зарастания свободной поверхности клетками и удаления вставок получаются одинаковые, стандартизованные пустые пространства, в которых можно отслеживать дальнейшее зарастание клетками.

Материалы и оборудование

• Оборудованный культуральный блок для работы с клетками млекопитающих.

• Клеточная культура, флаконы 25 см².

• Полная питательная среда DМЕМ, 20 мл.

• Раствор 0,25 %-ный трипсина, 5 мл.

• Раствор PBS, 50 мл.

• Планшеты для адгезионных клеток 6-луночные, 3 шт.

• Дозаторы объемом 0,2 мл, 1,0 мл, 5,0 мл.

• Наконечники объемом 0,2 мл, 1,0 мл, 5,0 мл.

• Пробирки типа Эппендорф, 5 шт.

• Этанол 70 %-ный, 0,5 л.

• Карандаш, блокнот для записей.

Поставленные задачи