Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

6. Поместить камеру под микроскоп (увеличение 10х) и подсчитать количество окрашенных (синих) и неокрашенных клеток в 25 серых квадратах (см. илл. 6) на двух полях камеры (N₁ и N₂). Найти среднее значение N_ср. Подсчитать количество клеток в растворе и заполнить таблицу.

Полученные результаты

1. Протоколы проведенного окрашивания флуоресцентным красителем.

2. Фотографии или зарисовка клеток окрашенного препарата при максимальном увеличении.

3. Описание наблюдаемых окрашенных клеточных структур.

4. Протокол окрашивания трипановым синим.

Вопросы по теме

1. Для чего необходимо витальное окрашивание клеток и окрашивание фиксированных клеток?

2. Приведите примеры красителей для различных органелл.

3. Опишите достоинства и недостатки окрашивания с использованием трипанового синего.

Вопрос для самостоятельного изучения

Опишите принцип метода иммуноцитохимической окраски клеток.

Лабораторная работа 5. Анализ цитотоксичности химических соединений

Цель работы

Освоить методику оценки выживаемости клеток и оценить цитотоксичность предоставленного препарата.

Введение

Цитотоксичность – появление патологических изменений в клетках при воздействии на них физических, химических и биологических агентов. В зависимости от силы и механизма воздействия изменения могут проявляться в широком спектре – от нарушений прохождения клетки по клеточному циклу до ее гибели. Оценка цитотоксичности потенциальных фармацевтических субстанций является необходимым доклиническим этапом исследования. С учетом различных задач могут быть интересны как цитотоксичные, так и нетоксичные соединения. Например, ведется поиск агентов (вещества, условия облучения и т. д.), способных повреждать опухолевые клетки, а для большинства будущих лекарств на этапе разработки требуется отсеять обладающие неспецифической цитотоксичностью.

Для оценки цитотоксичности химических соединений в качестве сигнала для детекции можно использовать продукты метаболизма живых клеток или определять количество погибших клеток. В идеальном случае оба эти подхода для одного соединения должны давать обратно пропорциональные результаты. В реальных тестах численные результаты могут зависеть от метода анализа и измеряемого параметра, по которому оценивается эффект. В тесте на цитотоксичность оцениваются активность клеточных ферментов, целостность мембраны или количество метаболитов. На полученные результаты может существенно влиять время инкубации с тестируемым соединением – так, метаболические изменения в клетках происходят раньше, чем их гибель.

Методы для оценки цитотоксичности на культурах клеток можно разделить на прижизненные и требующие разрушения образца. В зависимости от измеряемого параметра выделяют три группы тестов для определения цитотоксичности. Они основаны на:

1) поглощении или трансформации клетками красителя, при этом регистрируется суммарное количество живых или мертвых клеток;

2) анализе компонентов клеточного метаболизма, таких как внутриклеточная концентрация ионов кальция, АТФ, pH и др.;

3) детекции сигнала встроенных генно-инженерными методами репортерных генов.

Одним из распространенных методов детекции мертвых клеток является окраска клеточной суспензии трипановым синим или нейтральным красным. Краска легко проникает в мертвые клетки, в то время как для пиноцитоза краски в живые клетки требуется время. Подсчет окрашенных клеток производится на гемоцитометре или на проточном цитометре.

Другой широко применяемый метод основан на появлении окрашенных соединений при метаболизировании живыми клетками добавленных реагентов. Чаще всего используются соли тетразолия МТТ, МТS и XTT, которые восстанавливаются оксидоредуктазами живых клеток в окрашенный продукт. Эти реагенты имеют некоторые различия (например, метаболизированный MTS растворим в воде и менее токсичен по сравнению с МТТ). Количество образовавшегося продукта определяют колориметрическими методами, считая оптическое поглощение пропорциональным количеству живых клеток.

По сравнению с колориметрическими флуоресцентные методы демонстрируют большую чувствительность. Изначально использовали флуоресцирующие органические молекулы или субстраты для клеточных ферментов, превращающихся в флуоресцирующий продукт. В настоящее время также применяются флуоресцентные белки, гены которых встраивают в геном изучаемой клетки, и их экспрессия практически не влияет на ее жизнедеятельность. Детекция флуоресцентных белков неинвазивна и позволяет наблюдать за клетками в реальном времени.

В этой лабораторной работе для изучения цитотоксичности используется коммерческий раствор аламарового синего – натриевой соли резазурина. Резазурин, не имеющий флюоресценции и нетоксичный для клеток в рабочих концентрациях, способен встраиваться в электрон-транспортную цепь как промежуточный акцептор электронов и необратимо восстанавливаться до резоруфина, обладающего сильной флуоресценцией в красной части спектра.

Материалы и оборудование

• Оборудованный культуральный блок.

• Планшетный флуориметр.

• Клеточная культура U87 MG, 2-й день после посева.