Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

• Флаконы 25 см², 5 шт.

• Базовая питательная среда DМЕМ, 10 мл.

• Полная питательная среда, 20 мл.

• Раствор 0,25 %-ный трипсина, 5 мл.

• Раствор PBS, 50 мл.

• Планшеты для адгезионных клеток 96-луночные, 5 шт.

• Дозаторы объемом 0,2 мл, 1,0 мл, 5,0 мл.

• Наконечники объемом 0,2 мл, 1,0 мл, 5,0 мл.

• Пробирки центрифужные с завинчивающейся крышкой, объемом 15 мл, 5 шт.

• Микропробирки объемом 1,5 мл, 5 шт.

• Этанол 70 %-ный, 0,5 л.

• Карандаш, блокнот для записей.

Поставленные задачи

1. Рассеять клетки из культурального флакона по лункам 96-луночного планшета.

2. Подготовить пробы цитотоксичных соединений в различных концентрациях в стерильных условиях.

3. Оценить эффективность действия цитотоксичных соединений на выживаемость клеток, используя тест с аламаровым синим.

Ход работы

I. Простерилизовать ультрафиолетом и включить ламинарный шкаф. Асептически внести реактивы и расходные материалы в рабочую зону ламинарного шкафа.

II. Промыть клетки, подготовленные на предыдущем занятии, раствором PBS.

1. Убрать питательную среду из культурального флакона.

2. Залить 2 мл раствора PBS в культуральный флакон по стенке, стараясь не попасть на клетки. Покачать, убрать раствор пипеткой в емкость для слива.

III. Снять клетки с поверхности флакона раствором трипсина, как описано в Лабораторной работе 3.

IV. Клеточную суспензию тщательно ресуспендировать, 10 мкл суспензии нанести на подготовленную камеру Горяева и выполнить подсчет количества клеток в 1 мл, как описано в Лабораторной работе 3.

V. Посеять по 6000 клеток в лунки 96-луночного планшета.

1. Приготовить суспензию клеток: развести средой до концентрации 60 клеток в 1 мкл.

2. В каждую лунку поместить по 100 мкл полученной суспензии. Оставить прикрепляться и адаптироваться клетки в инкубаторе на 16–24 ч.

VI. Добавить исследуемые вещества в лунки выбранных столбцов 96-луночного планшета.

1. Приготовить серийные разведения предоставленных веществ с шагом 5х: 50 мкм, 10 мкм, 2 мкм, 400 нм, 80 нм, 16 нм.

2. Добавить по 10 мкл раствора препарата в соответствующую лунку с клетками.

3. Отметить в журнале расположение лунок с препаратами и контрольных лунок без препаратов. Подписать планшеты и поместить в СО₂-инкубатор.