Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Вопросы для самостоятельного изучения

1. Какие еще ферменты, кроме трипсина, используются при снятии клеток с культуральных флаконов?

2. Опишите три класса трансмембранных белков, обеспечивающих адгезию клеток к поверхности.

3. Как проводят субкультивирование суспензионных культур клеток?

Лабораторная работа 4. Окрашивание клеток клеточной культуры млекопитающих

Цель работы

Освоить метод подсчета живых клеток по окраске трипановым синим и научиться прижизненной окраске клеток.

Введение

В зависимости от цели эксперимента можно подобрать подходящий протокол для визуализации той или иной структуры в клетке, ткани или органе. Чтобы лучше различать клеточные препараты, их окрашивают, используя разные химические соединения. Процесс окрашивания может быть основан на различных физико-химических и биологических процессах; например, гематоксилин окрашивает базофильные (окрашиваемые красителями с щелочной реакцией) элементы тканей и клеток в присутствии солей металлов. Возможно накопление красителей в определенных структурах – так, ряд флуоресцентных красителей на основе BODIPY и его производные используются для визуализации различных клеточных мембранных структур благодаря связыванию с липидами. Делокализованные органические катионы могут накапливаться в митохондриях благодаря их мембранному потенциалу. Помимо окрашивания клеточных структур в соответствии с их физико-химическими свойствами (гидрофобность/гидрофильность, кислое или основное свойство, локальный заряд), возможно и окрашивание структур, обогащенных определенными белками. В частности, распространено иммуноокрашивание с помощью антител, позволяющее следить за конкретными изучаемыми молекулами белков и их взаимодействиями.

Некоторые красители способны свободно проникать внутрь клеток. Другие же проникают в клетку только при наличии незначительного повреждения мембраны. К таким красителям относится трипановый синий (рис. 9), широко используемый для определения поврежденных, нежизнеспособных клеток в суспензионных и адгезионных культурах.

Рис. 9. Структура трипанового синего

При кратковременной инкубации неповрежденные мембраны непроницаемы для трипанового синего. Накопление красителя внутри клетки является индикатором повреждения клеточной мембраны.

Большинство красителей не способны проникать внутрь интактной клетки (например, DAPI, окрашивающий ДНК), поэтому требуется провести пермеабилизацию мембраны с помощью поверхностно-активных веществ (тритон Х-100, сапонины) или в ходе фиксации клеток (например, при спиртовой фиксации).

Для микроскопии клетки нередко фиксируют, что приводит к их гибели, но позволяет сохранить структуру клеток или тканей. Это бывает необходимо для детальных исследований или хранения образцов, поскольку строение клеток динамично в ходе жизнедеятельности, а при гибели – от воздействия как собственных ферментов, так и микроорганизмов при хранении – клеточная структура достаточно быстро деградирует.

В настоящее время разработано множество прижизненных красителей, которые позволяют не только окрашивать структуры живых клеток, но и наблюдать динамику внутриклеточных процессов.

Витальная (прижизненная) окраска клеточных культур

При витальной окраске клеточных структур краситель проникает в клетки в результате диффузии через неповрежденную клеточную мембрану. Для этой цели используют низкомолекулярные синтетические соединения, которые способны флуоресцировать внутри живой клетки и не оказывают в рабочих концентрациях влияния на ее жизнедеятельность. Можно целенаправленно окрашивать различные клеточные органеллы с помощью таких красителей, потому они и нашли широкое применение в биомедицинских исследованиях.

Красители Hoechst (илл. 4А) связываются с ДНК в живых клетках и организмах (так, pcHoechst был использован для отслеживания перемещения ДНК фрагментов in vivo в клетках рыбок данио). При связывании с ДНК флуоресценция увеличивается примерно в 30 раз, обеспечивая хорошее соотношение сигнал/шум. Hoechst – неинтеркалирующие красители, они связываются по малой бороздке ДНК в областях, богатых АТ-парами оснований. Эти красители часто используются в экспериментах для одновременной визуализации ядра и других клеточных структур. Разработан также инфракрасный зонд Hoechst-IR для визуализации некротических тканей in vivo путем связывания с внеклеточной ДНК.

Для выявления митохондрий на основе делокализованных органических катионов созданы флуоресцентные красители – к ним, в частности, относятся молекулы серии MitoTracker (илл. 4B), – которые селективно накапливаются в мембранах митохондрий. Флуоресцентные зонды имеют разные спектры флуоресценции, и выбор красителя определяется задачей исследования. Кроме того, MitoTracker® Deep Red, например, сохраняет свои флуоресцентные свойства после фиксации клеток, а MitoTracker® Green FM рекомендуется для работы с нефиксированными клетками. Эти красители также могут использоваться в проточной цитометрии для полуколичественного измерения митохондриальной массы. Красители применяются и для оценки функциональной активности органелл, а не только их структуры. Так, краситель родамин-123 окрашивает митохондрии с высоким трансмембранным потенциалом, т. е. функционально активные. При снижении функциональной активности или нарушении структуры митохондрий флуоресценция родамина-123 снижается, что позволяет оценивать энергетическое состояние клеток.

Для изучения лизосом используют, в частности, флуоресцентые зонды LysoTracker (илл. 4С). Краситель LysoTracker Red имеет длину волны возбуждения 576 нм и излучение 590 нм, представляет собой гидрофобное слабое основание, избирательно накапливается в кислых везикулярных компартментах, преимущественно в поздних эндосомах и лизосомах, и используется для изучения колокализации разнообразных структур с этими органеллами.

Для визуализации эндоплазматического ретикулума в живых или фиксированных клетках обычно используются катионные производные, обладающие высокой селективностью (илл. 4D).

Конъюгированные с флуорофором церамиды активно включаются в мембраны аппарата Гольджи, примером такого красителя служит BODIPY TR C5-церамид (Ex/Em, 589/616 нм), применяемый для окрашивания как растительных, так и животных клеток (илл. 4Е).

Помимо низкомолекулярных красителей, прижизненное мечение клеточных компонентов возможно с помощью химерных белков, в которых одна часть – специфически локализующийся в клетке белок, а вторая – белковая метка, например, флуоресцентный белок (см. Приложение, табл. 2). Еще одним инструментом клеточной визуализации являются самометящиеся белковые метки, например HaloTag, присоединяющий хлоралкановый линкер (илл. 4F). Такой белок может быть генно-инженерными способами конъюгирован с белками различной локализации. Для него доступны многочисленные лиганды, в том числе различные флуоресцентные красители. Дозировка красителей может варьироваться, чтобы пометить все или несколько молекул, что необходимо для отслеживания отдельных молекул.

Материалы и оборудование для выполнения витального окрашивания

• Культуральный блок, оборудованный для работы с клетками млекопитающих.

• Клеточная культура, подготовленная на предыдущем занятии в планшетах для адгезионных клеток.

• Флаконы культуральные, 25 см².

• Полная питательная среда, приготовленная в ходе предыдущей лабораторной работы, 20 мл.

• Раствор 0,25 %-ный трипсина, приготовленный в ходе предыдущей лабораторной работы (размороженный), 5 мл.