Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Илл. 15. Митотические стадии клеток линии HeLa: А – схематический вид стадий митоза животной клетки; Б – Г – микрофотографии клеток HeLa в различных стадиях митоза при малом увеличении (40х)

Илл. 16. Срез растительной ткани (из кончиков корней лука): А – схематический вид стадий митоза растительной клетки; Б – микрофотография митотических клеток при большом увеличении (100х)

Илл. 17. Микрофотография апоптотической клетки (на стадии апоптотического тельца) линии HeLa при большом увеличении (100х)

II. Основы световой микроскопии

Лабораторная работа 8. Световая микроскопия срезов тканей и культивируемых клеток млекопитающих. Ядро, клеточная стенка

Цель работы

Проанализировать структурную организацию клетки и цитоплазмы, определить ядро, клеточную стенку.

Введение

Окрашивание клеток происходит благодаря накоплению красителя в отдельных компонентах клетки и химическим реакциям, приводящим к изменению его окраски и к фиксации в микроструктурах клетки. Некоторые красители достигают эффекта, растворяясь в визуализируемых компонентах, например, в липидах клеточных мембран. Другие – вызывают химическую реакцию, например, при окрашивании белков в клетке комплексами железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Окрашивание может быть двухэтапным: вначале специфический, но невидимый глазу препарат локализуется в клетках, а затем он визуализируется вторым компонентом («протравой»). Визуализация возможна за счет не только оптического поглощения красителя, но и флуоресценции, присущей многим красителям, что позволяет увеличить чувствительность окрашивания.

Один из самых распространенных методов окраски – гематоксилином и эозином. Метод применяется в том числе в гистологии. В качестве основного красителя используют гематоксилин, который окрашивает синим базофильные клеточные структуры. Исторически их так и определяли – как содержащие кислотные группы и взаимодействующие с основными красителями. Второй компонент – спиртовой кислый краситель эозин Y – окрашивает клеточные структуры, имеющие основные (щелочные, эозинофильные) свойства, в красно-розовый цвет.

Базофильные структуры могут быть ассоциированы с нуклеиновыми кислотами. К таким структурам относятся не только ядро клетки, но и рибосомы, и содержащие большое количество РНК участки цитоплазмы. Эозинофильные структуры могут быть образованы белковыми компонентами, например, внеклеточная окраска может быть обеспечена коллагеном. Цитоплазма является эозинофильной средой. Эритроциты, в которых нет ядра и мало РНК, прокрашиваются ярко-красным цветом. Именно благодаря различному окрашиванию гранул в цитоплазме появились названия гранулоцитов крови: базофильные, эозинофильные и нейтрофильные. Некоторые участки клеток, в частности, богатые липидами гидрофобные области, не прокрашиваются или плохо прокрашиваются гематоксилином/эозином.

Некоторые методы окрашивания могут использоваться как для визуализации в световой микроскопии, так и для контрастирования в электронной микроскопии. К таковым относится, например, окрашивание серебрением, когда препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем восстановителями. При этом ядра клеток приобретают светло-коричневый цвет.

Ядро – это одна из ключевых структур клетки, которая содержит генетический материал и участвует в регуляции клеточных процессов. Клетки могут терять ядро в ходе дифференцировки и адаптации к специальным функциям, однако на ранних стадиях ядро все равно присутствует. В зрелом состоянии эритроциты у человека лишены ядра. Процесс созревания эритроцита, известный как эритропоэз, начинается в костном мозге, где ядерные эритроидные предшественники проходят серию стадий развития, включая стадии пролиферации и дифференцировки. В итоге, когда эритроциты достигают зрелости, их ядра выталкиваются из клеток, чтобы максимально освободить место для гемоглобина, который обеспечивает перенос кислорода с кровью.

Ядро имеет характерную округлую или овальную форму и обычно располагается в центре клетки. Однако существуют различные варианты исключений по форме и расположению ядра. Встречаются многоядерные клетки и клеточные производные, например, скелетные мышечные клетки (миоциты), некоторые из клеток печени (гепатоциты), синцитиотрофобласт в плаценте при беременности. Миоциты содержат несколько ядер, расположенных вдоль их длинных волокон. Многоядерность миоцитов является результатом слияния нескольких прекурсорных клеток, известных как миобласты, в процессе эмбрионального развития и роста. Каждое ядро в мышечной клетке контролирует свою часть клеточного объема и участвует в регуляции белкового синтеза, необходимого для сокращения мышц и выполнения их функций. Некоторые гепатоциты также могут быть многоядерными: они образуются в результате слияния нескольких клеток в процессе развития печени и в ответ на некоторые патологические состояния, например, при гепатоцитарной гиперплазии или регенерации печени после повреждения. Многоядерные гепатоциты обычно сохраняют свою функциональность и продолжают выполнять основные функции печени, такие как метаболизм, детоксикация и синтез белков. Синцитиотрофобласт – это многоядерная синцитиальная структура, которая является частью плаценты и играет важную роль в поддержании беременности и развитии плода. Она образуется при слиянии клеток цитотрофобласта – первичной клеточной массы, которая развивается из зародышевых тканей и формирует внешний слой плаценты.

Также встречается разделение ядра на несколько частей или одновременно несколько ядер вследствие нарушений в процессе деления клеток. Например, в раковых клетках, многие из которых характеризуются нестабильным делением, могут возникать аномалии, включая анеуплоидные или полиплоидные наборы хромосом и множественные ядра.

У большинства эукариотических клеток ядро располагается в центре, что позволяет равномерно распределять генетическую информацию и обеспечивает эффективное функционирование клетки. Однако есть несколько исключений. В клетках соединительной ткани, таких как фибробласты, ядро часто располагается на периферии. Это связано с активным синтезом внеклеточного матрикса, подвижностью клетки и ее участием в ремоделировании тканей. У некоторых типов нейронов ядро может быть смещено к одному из полюсов клетки. Это обусловлено особенностями морфологии нейронов и обеспечивает эффективное функционирование клетки при передаче сигналов по длинным аксонам. В эпителиальных клетках ядро может располагаться ближе к базальной мембране или к апикальной поверхности в зависимости от их функций и специализации. Например, в кубических эпителиальных клетках ядро чаще всего располагается ближе к центру, тогда как в вытянутых эпителиальных клетках, таких как цилиндрический эпителий кишечника, оно может быть смещено к базальной мембране. У растительных клеток ядро часто смещается из-за наличия органоидов – хлоропластов и митохондрий, вакуолей и больших включений, которые занимают большую часть клеточного объема.

Помимо классической округлой или овальной формы ядра встречаются и другие варианты. Наблюдаются полиморфные ядра, имеющие неопределенную или изменчивую форму, не поддающуюся точному описанию, ядра, состоящие из нескольких сегментов, – в клетках с высокой степенью морфологической изменчивости, например, в клетках иммунной системы, в частности, в сегментоядерных нейтрофилах. В клетках мышечной ткани, особенно в скелетных мышцах, ядра на периферии многоядерной клетки чаще всего имеют пластинчатую форму. В эпидермисе кожи клетки вместе с их ядрами постепенно уплощаются по мере продвижения от базального слоя к поверхности. При некоторых патологических состояниях или генетических дефектах ядро принимает необычные формы – полигональную, пирамидальную или даже аномально удлиненную. В гибнущих клетках ядро может иметь размытые границы, а четкая форма – отсутствовать.

В ядре выделяют ядерную оболочку (кариолемма, нуклеолемма) и ядерное вещество (нуклеоплазма, кариоплазма, или ядерный сок), в котором могут наблюдаться хроматин и ядрышки (нуклеолусы). Структура ядерной оболочки при световой микроскопии практически не определяется, однако известно, что она состоит из двух мембран, наружной и внутренней, которые разделены перинуклеарным пространством шириной несколько десятков нанометров и смыкаются в области ядерных пор. Наружная мембрана ядерной оболочки неразрывно связана с эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР), который является системой мембран, расположенных в цитоплазме клетки. На внешней поверхности наружной мембраны ядра могут располагаться рибосомы, а сама мембрана окружена сетью промежуточных филаментов. Внутренняя мембрана ядерной оболочки содержит интегральные белки, связанные с ядерной пластинкой (ламиной), которая представляет собой сеть белковых филаментов и обеспечивает поддержку формы ядра, упорядоченную укладку хроматина и структурную поддержку ядерных пор.

Ядерные поры – это специализированные структуры в ядерной оболочке, отвечающие за транспорт молекул между ядром и цитоплазмой. Ядерная пора образована кольцевидным комплексом белков, через канал диаметром около 9 нм в центре комплекса могут двигаться малые водорастворимые молекулы и ионы. Ядерные поры играют решающую роль в регуляции транспорта между ядром и цитоплазмой, обеспечивая специфический и селективный транспорт различных молекул, включая РНК и белки. Транспорт через ядерные поры осуществляется пассивно или при участии специализированных белков.

Хроматин (от греч. χρώμα – цвет) – это комплекс ДНК, РНК и белков, который образует структуру хромосом в ядре клетки. В интерфазном ядре хромосомы не видны как отдельные структуры, а представлены двумя типами хроматина в зависимости от транскрипционной активности отдельных участков хромосом: активный хроматин – эухроматин – находится в деспирализованном состоянии и слабее окрашивается при микроскопии, а неактивный – гетерохроматин, более плотный, компактный – представлен в виде мелких зернышек и глыбок, окрашиваемых основными красителями. Хроматин в различных участках может переходить из одной формы в другую, и эти изменения в его структуре позволяют клеткам регулировать, какие гены будут экспрессированы, а какие подавлены в ответ на внешние сигналы и внутренние потребности клетки. Отдельные скопления гетерохроматина наблюдаются под ядерной оболочкой и в области ядрышек. Особым типом гетерохроматина является тельце Барра, представляющее собой конденсированную неактивную X-хромосому в клетках с более чем одной X-хромосомой. При геномных мутациях если в клетке больше двух X-хромосом, то все X-хромосомы кроме одной будут представлены отдельным тельцем Барра. При некоторых типах рака наблюдается возможность реактивации тельца Барра.

Ядрышко представляет собой структуру ядра, образованную петлями хромосом, называемыми ядрышковыми организаторами (у человека это участки 13-й, 14-й, 15-й, 21-й и 22-й хромосомы, содержащие гены рибосомных РНК). В ядрышках происходят синтез рибосомной РНК (рРНК) и сборка субъединиц рибосом.

Вокруг ядра располагается цитоплазма, ограниченная по периферии плазмолеммой (цитолеммой, плазматической мембраной, или внешней клеточной мембраной). Цитоплазма состоит из воды, растворенных в ней органических и неорганических молекул и погруженных в нее органелл. Цитоплазма пронизана цитоскелетом, сетью белковых волокон, которая поддерживает форму клетки, обеспечивает ее движение и участвует во многих клеточных процессах, таких как деление, транспорт органелл и передача сигналов. Также в цитоплазме могут наблюдаться различные включения, структуры, запасающие пигменты, питательные и другие вещества, которые клетка накапливает для временного хранения или использования.

Плазмолемма представляет собой оболочку, окружающую клетку и отделяющую ее от внешней среды. Это сложная структура, состоящая из двух слоев фосфолипидов с протеинами, гликопротеинами и гликолипидами, встроенными в эти слои. Внешняя мембрана выполняет ряд важных для клетки функций, включая защиту, регуляцию проницаемости, коммуникацию и взаимодействие со внешней средой за счет белков-рецепторов, распознавание и идентификацию других клеток и внеклеточного вещества, адгезию и клеточное движение. На цитоплазматической мембране клетки можно наблюдать различные структуры и образования. Микроворсинки – маленькие выпячивания цитоплазматической мембраны, которые обычно содержат актиновые филаменты и другие белки цитоскелета, – могут участвовать в различных процессах, таких как адгезия, миграция клеток и поглощение питательных веществ. У некоторых клеток наблюдаются псевдоподии и другие временные или постоянные выступы цитоплазматической мембраны, которые могут использоваться клеткой для перемещения, захвата пищи или образования контактов с другими клетками. Могут наблюдаться инвагинации мембраны в процессе поглощения веществ или более крупных внеклеточных структур. Так, эндоцитоз является процессом, при котором клетка образует инвагинацию мембраны, чтобы захватить и поглотить внешние частицы или жидкость. Частными примерами эндоцитоза являются пиноцитоз и фагоцитоз. Существует и обратный процесс – экзоцитоз, когда со стороны цитоплазмы происходит слияние мембранных пузырьков с цитоплазматической мембраной клетки. Сама плазмолемма также способна образовывать выпячивания, которые впоследствии отшнуровываются в форме мембранных пузырьков.

У некоторых типов эукариотических клеток, например, грибов и растений, вокруг цитоплазматической мембраны могут визуализироваться клеточные стенки. Клеточная стенка предоставляет опору и защиту для клетки, обеспечивая ей определенную форму и защищая от механических повреждений. У растений клеточная стенка играет ключевую роль в поддержании тургорного давления, которое обеспечивает их форму и жесткость. Это особенно важно для растений, которые используют тургорное давление для поддержания прямостоячего положения и обмена газов. Клеточная стенка может регулировать поток веществ в клетку и из клетки. У многих организмов клеточная стенка служит основой для построения тканей и органов, обеспечивая форму и прочность.

Материалы и оборудование

1. Световой микроскоп с набором объективов 40х–100х.

2. Набор готовых препаратов для микроскопии.

3. Иммерсионное масло.