Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

1. Посеять клетки в 6-луночные планшеты.

2. Нанести в монослое клеток царапины, имитирующие повреждение ткани.

3. Наблюдать зарастание царапин через регулярные промежутки времени.

Ход работы

1. Простерилизовать ультрафиолетом и включить ламинарный шкаф. Асептически внести реактивы и расходные материалы в рабочую зону ламинарного шкафа.

2. Снять клетки с поверхности флакона раствором трипсина, как описано в Лабораторной работе 3.

3. Определить концентрацию клеток в суспензии, как описано в Лабораторной работе 3.

4. Приготовить 6 мл суспензии клеток с концентрацией 200 клеток/мкл. Посеять 200 000 клеток в лунки 6-луночного планшета (в каждую лунку поместить по 1 мл полученной суспензии). Оставить прикрепляться и адаптироваться клетки в CO₂-инкубаторе на 16–24 ч для прикрепления и роста клеток.

5. На следующий день сделать две перпендикулярные царапины на слое адгезионной культуры при помощи носика на 200 мкл.

6. Сфотографировать рубец через 12, 24 и 48 ч, используя световой микроскоп (пример ожидаемого изображения приведен на рис. 10).

Рис. 10. А – фото «затягивания рубца»; Б – клетки царапины при миграции

Полученные результаты

1. Протокол метода «затягивания рубца».

2. Фотографии зарастающей царапины через определенные периоды времени.

Вопросы по теме

1. Почему клетки мигрируют преимущественно в сторону свободной поверхности?

2. Предложите, как можно ускорить или замедлить миграцию клеток.

Лабораторная работа 7. Принципы криоконсервации клеток. Низкотемпературные холодильники и криохранилища

Цель работы

Приготовить криостоки (замороженные аликвоты суспензии клеток для длительного хранения) клеточной линии, освоив методику криоконсервации.

Введение

Многие живые организмы способны выдерживать низкие температуры, при этом метаболизм в клетках максимально замедляется. Именно на этом феномене основан метод криоконсервации живых клеток. В процессе замораживания в клетках могут образовываться кристаллы воды, что приводит к повреждению и гибели клеток. Чтобы снизить эффект кристаллизации воды, при замораживании к клеткам добавляют специальные вещества, так называемые криопротекторы, или криоконсерванты. Такие криоконсерванты, как пропиленгликоль, этиленгликоль, глицерин, диметилсульфоксид, способны проникать сквозь мембрану клеток и уменьшать размеры кристаллов воды. С помощью криопротекторов наряду с некоторыми электролитами и сахарами (сахароза, трегалоза, лактоза, маннит) можно повысить осмотическую силу растворителя и снизить вероятность образования межклеточного льда.

Для криоконсервации клеток млекопитающих обычно используют глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО). ДМСО – полярный апротонный растворитель, который может растворять полярные и неполярные соединения и легко смешиваться со многими органическими растворителями и водой. Он замерзает при +18,5 °C, имеет низкую стоимость и незначительную цитотоксичность (несильно снижает жизнеспособность большинства клеточных линий при концентрации до ~1 %). Клетки переносят концентрации до 5–12 % при пониженной до нескольких градусов по Цельсию температуре, что делает ДМСО подходящим веществом для криоконсервации. На практике криозащитные растворы часто содержат несколько различных криопротекторов. Многокомпонентность раствора для замораживания обеспечивает низкую концентрацию каждого компонента в отдельности, что уменьшает общую токсичность раствора.

Крупные клетки млекопитающих замораживают медленно, хотя уменьшить размер кристаллов льда помогает резкое замораживание, например в жидком азоте, как это делают с бактериями. При медленном замораживании клетки в среде охлаждаются до температуры ниже точки замерзания. При этом между клетками начнет образовываться лед. Между нарастающими ледяными массами остается так называемая незамерзшая фракция, в которой заключены большинство клеток и растворенных веществ. Концентрации сахаров, солей и криопротектора (например, ДМСО) увеличиваются, а объем незамороженной фракции уменьшается. Увеличение осмотической силы вызывает отток воды из клеток. Медленное охлаждение необходимо для того, чтобы обеспечить достаточный отток воды и свести к минимуму вероятность образования внутриклеточного льда. В конечном итоге вязкость незамороженной фракции становится слишком высокой для какой-либо дальнейшей кристаллизации, и оставшаяся фракция превращается в близкий к аморфному лед. Таким образом, при использовании криопротекторов больше криоповреждений возникает при быстром замораживании клеток, а медленное замораживание показывает большую выживаемость клеток после разморозки. Чтобы избежать повреждения клеток при криоконсервации, необходимо поддерживать рН среды, осмотическое давление и подобрать оптимальную концентрацию криопротектора. Задача оптимизации замораживания и сохранения клеточных культур пока еще решена не полностью.

Криопротекторы применяются не только для хранения культур клеток, но и для сохранения клеток органов и биоматериала при криохирургии, переливании крови, искусственном оплодотворении, трансплантации костного мозга. Многочисленные крио-банки по всему миру развивают и апробируют новые методы криоконсервации.

Материалы и оборудование

• Культуральный блок с оборудованием для стерильной работы с клетками.

• Клеточная культура, подготовленная на предыдущих занятиях.

• ДМСО, аликвота 1 мл.