Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

• Раствор PBS, приготовленный в ходе предыдущей лабораторной работы, 50 мл.

• Раствор трипанового синего 0,5 %-ный в PBS, 2 мл.

• Пробирки объемом 2 мл.

• Дозаторы.

• Наконечники для пипеток.

• Флуоресцентный краситель Hoechst 33342 или MitoТracker.

Поставленные задачи

1. Приготовить образцы с различной долей живых клеток и окрасить их трипановым синим.

2. Выполнить прижизненное окрашивание клеток флуоресцентным красителем. Предположить, что окрасит представленный краситель.

Ход работы

I. Окрашивание прижизненным (витальным) красителем.

1. Подготовить рабочую зону (стерилизация УФ-лампой, включение ламинарного шкафа).

2. Асептически внести в рабочую зону краситель.

3. Развести предоставленный краситель до концентрации 20х (кратность концентрированного раствора красителя указана на фасовке) стерильным буферным раствором PBS.

4. Отметить три лунки на 96-луночном планшете с посеянными ранее клетками, в одну добавить 5 мкл красителя, во вторую – 1 мкл красителя, третья, без красителя, – контрольная лунка с клетками только со средой. Инкубировать 10 мин для Hoechst и 30 мин для MitoТracker или его аналогов.

5. Сфотографировать клетки на флуоресцентном микроскопе (см. илл. 5).

II. Окрашивание предварительно фиксированных клеток красителем DAPI.

1. В лунках с клетками сменить среду на раствор для фиксации – 4 %-ный параформальдегид в PBS (pH 7,2) на 15 мин. Объем раствора на каждую лунку – 200 мкл.

2. После фиксации клетки 2 раза промыть PBS.

3. Сменить PBS на пермеабилизирующий буфер (0,25 % Triton X-100 в PBS) на 15 мин.

4. Клетки 2 раза промыть PBS.

5. Добавить к клеткам по 100 мкл раствора DAPI, инкубировать 10 мин, защищая от света.

6. Сфотографировать клетки с помощью флуоресцентного микроскопа, при освещении с длиной волны света ~400 нм.

III. Окрашивание красителем трипановым синим.

1. Открепить высаженные ранее адгезионные клетки от поверхности культурального флакона, как описано в Лабораторной работе 3.

2. К раствору трипсина с клетками добавить 4,5 мл полной ростовой среды, аккуратно ресуспендировать.

3. В две пробирки внести по 0,5 мл полученной суспензии клеток. В одну добавить 0,5 мл полной ростовой среды, в другую – 0,5 мл 70 %-ного этанола. Инкубировать в СО₂-инкубаторе 10 мин.

4. Обе клеточные суспензии после инкубации тщательно ресуспендировать и перенести в другую пробирку по 0,5 мл из каждой. К 0,5 мл клеточной суспензии добавить 0,1 мл раствора трипанового синего, ресуспендировать, инкубировать 10 мин при 37 °C*.

*При работе с трипановым синим нужно выдерживать время окрашивания, поскольку он может неспецифически окрасить живые клетки в синий цвет при продолжительном времени инкубации.

5. Внести 10 мкл полученного окрашенного раствора на подготовленную камеру Горяева.