Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

5. Пипеткой полностью собрать клетки и перенести суспензию клеток в стерильную центрифужную пробирку.

6. Центрифугировать в течение 5 мин при 1000 об/мин (или 200–300 g) при комнатной температуре.

7. По окончании центрифугирования аккуратно отобрать пипеткой надосадочную жидкость (см. илл. 3Б) и слить в отходы.

8. Добавить к сформированному во время центрифугирования осадку 3 мл полной ростовой среды, тщательно ресуспендировать до образования гомогенной суспензии одиночных клеток.

V. Подсчитать количество клеток в полученном растворе в камере Горяева.

1. Подготовить камеру (она должна быть чистой и сухой). Аккуратно и без сильного нажима притереть к поверхности покровное стекло до появления радужных полосок по краям.

2. Нанести на боковую поверхность (стык с покровным стеклом) камеры 10 мкл полученной клеточной суспензии.

3. Поместить камеру под микроскоп (объектив 10х) и подсчитать количество клеток в 25 заштрихованных квадратах (N) на двух полях камеры. Найти среднее значение N_ср.

4. Такие же клетки внести в лунки для измерений на стекло слайда для автоматического счетчика клеток*. По протоколу производителя прибора выполнить измерения.

*Подсчет клеток может осуществляться автоматически с помощью счетчика клеток Countess в специальных пластиковых одноразовых слайдах. В слайдах имеется две камеры, по одной с обеих сторон, объемом 10 мкл каждая. Прибор производит подсчет клеток автоматически при установке слайда в гнездо на фронтальной панели и позволяет определить концентрацию клеток, если их количество 105–5×106 клеток/мл, поэтому сначала необходимо развести клеточную суспензию.

Для этого нужно залить 10 мкл суспензии в одну из камер слайда, чтобы определить концентрацию, и затем произвести соответствующее разведение. Например, при измерении прибор выдал значение количества клеток 107, это значит, что суспензию необходимо развести минимум в 10 раз.

После того как подобрана нужная концентрация клеток, надо смешать 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего и подождать 5 мин. Затем внести 10 мкл окрашенной суспензии во вторую камеру слайда. Прибор автоматически подсчитает количество живых клеток и выведет их процентное содержание.

VI. Рассчитать объемы суспензии клеток и среды для посева.

1. Подсчитать количество клеток в суспензии.

2. На основании полученных результатов рассчитать объем суспензии V₁, содержащий необходимое количество клеток для флакона Т25 и для 96-луночного планшета, считая рекомендуемый объем среды в этом флаконе как 5 мл и рекомендуемый объем среды в ячейке планшета как 100 мкл. Ориентировочная плотность посева 2х10⁴ клеток/см² корректируется преподавателем в ходе занятия в зависимости от используемой линии клеток.

VII. Рассадить открепленные клетки в составе суспензии в новые культуральные флаконы и планшеты.

1. Перенести рассчитанный объем суспензии в новый культуральный флакон и добавить полной ростовой среды до необходимого количества 5 мл. Подписать флакон, поместить в СО₂-инкубатор.

2. Подготовить планшеты для следующих занятий: перенести клетки в лунки планшетов (объем среды и количество клеток зависят от выбора следующих задач, количества студентов в группе и указываются преподавателем).

Полученные результаты

1. Протокол действий при пересеве адгезивной клеточной линии.

2. Расчеты количества клеток в работе.

3. Планшеты с клетками для следующих лабораторных работ.

Вопросы по теме

1. Что такое адгезивная клеточная культура?

2. Опишите процесс роста адгезивной культуры в культуральном флаконе.

3. Опишите основные шаги при пересеве адгезивной культуры.

4. Как разморозить культуру клеток из криобанка?

5. Для чего используют фермент трипсин в работе с клеточными линиями?

6. Какие существуют способы открепления клеток от субстрата?

7. Что такое культуральный флакон и чем он отличается от планшета?