Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

11.2. Транспорт РНК из материнского в зиготические макронуклеусы у Paramecium

Для сравнения последовательностей зародышевой линии и соматических в масштабах всего генома был бы необходим весьма сложный механизм, как для обеспечения массивного транспорта молекул РНК между ядрами, так и для осуществления очень большого числа взаимодействий по механизму спаривания, которые предполагаются в модели сканирования. Участником этих транс -нуклеарных «переговоров» у Paramecium оказался новый белок, Nowal, связывающийся с нуклеиновой кислотой (Nowacki et al., 2005). Nowal синтезируется незадолго до мейоза и сначала аккумулируется в материнском макронуклеусе, а затем, подобно Twil Tetrahymena, релокализуется в развивающийся зиготический макронуклеус. Мечение Nowal фотоактивируемым GFP позволило исследователям убедительно продемонстрировать, что этот белок транспортируется из ядер одного типа в ядра другого. Один домен этого белка может связывать РНК, а второй домен необходим и достаточен для межъядерного транспорта; таким образом, Nowal может быть транспортером РНК.

Nowal является существенным для развития жизнеспособного нового макронуклеуса, в том числе для элиминации транспозонов зародышевой линии и подгруппы IESs. Удивительно, но только те IESs, которые подвержены материнскому контролю, затрагиваются нокдауном Nowal; это позволяет предполагать, что этот белок участвует в trans-нуклеарном сопоставлении. Те IESs, которые нечувствительны к присутствию гомологичных последовательностей в материнском макронуклеусе, не зависят в своей эксцизии от Nowal, что подтверждает существование механистически различных классов IESs у Paramecium. Хотя нуклеиновые кислоты, связываемые Nowal in vivo, пока еще не известны, эффекты удаления Nowal согласуются с предлагаемой моделью сканирования (рис. 7.9) и позволяют предполагать, что этот белок может нести РНК, отобранные для «нацеливания» элиминации находящихся под материнским контролем IESs и транспозонов в развивающемся макронуклеусе.

Рис. 7.9. Модель сканирования РНК, объясняющая контроль делеции ДНК

^{Двунаправленная транскрипция большой части генома зародышевой линии происходит на ранних этапах развития и приводит к продукции scnRNAs. Эти РНК затем транспортируются в материнский макронуклеус, где любая встреча с гомологичной последовательностью включает их удаление из активного пула. Остающиеся, микронуклеус-специфичные РНК перенаправляются в развивающийся макронуклеус, где они «нацеливают» НЗК9-метилирование на гомологичные последовательности, создавая сигнал об их удалении из генома. Модель адаптирована из: Mochizuki et al. (2002)}

12. Заключение: элиминация ДНК как механизм защиты генома

Исследования RNAi, в особенности у растений и нематод, привели к гипотезе, что этот путь развился как защитный механизм, позволяющий клеткам контролировать пролиферацию вирусов и транспозонов путем разрушения mRNAs и «нацеливания» формирования гетерохроматина на этих геномных паразитах (Matzke and Birchler, 2005). Как уже упоминалось, перемещающиеся элементы, присутствующие в геноме зародышевой линии инфузорий, элиминируются в ходе развития соматического макронуклеуса, что эффективно сводит на нет их влияние. Сделанное на Tetrahymena наблюдение, что метилирование H3K9 маркирует геномные районы для делеции ДНК в ходе развития, заставляет предполагать, что использование RNAi у инфузорий в основе своей сходно с его ролью в формировании гетерохроматина у других эукариот: инфузории лишь продвинулись на шаг дальше и элиминируют гетерохроматин из своего соматического генома. Тем не менее, одним оригинальным вкладом, полученным в исследованиях на инфузориях, является идея о том, что специфические последовательности, «предназначаемые» RNAi для формирования (элиминации) гетерохроматина в ходе раннего развития, селектируются с помощью глобального сопоставления материнских соматического генома и генома зародышевой линии, начинающегося во время мейоза. Этот механизм эффективно защищал бы от вредоносных влияний транспозиции в зародышевой линии: любой новый транспозон, интегрирующийся в материнскую зародышевую линию, распознавался бы как чужеродный путем сравнения с соматическим геномом в ходе полового воспроизведения, что вело бы к его удалению из транскрибированного соматического генома потомков, ограничивая тем самым его будущее распространение.

У Tetrahymena scnRNAs, которые «нацеливают» элиминацию ДНК, весьма вероятно опосредуют trans-нуклеарные «переговоры» между геномом зародышевого пути и соматическим геномом. Неясно, весь ли микронуклеарный геном производит scnRNAs, но неопубликованные данные, полученные на Paramecium, позволяют предполагать, что по крайней мере большая его часть делает это. Анализы с помощью Норзерн-блоттинга выявили мейоз-специфичные, эндогенные короткие РНК, соответствующие клеточным генам, а также транспозонам и IESs (M.Nowacki et al., неопубликовано). Эти короткие РНК имеют длину ~25 нуклеотидов и четко отличаются от ~23-нуклеотидных siRNAs. По-видимому, они функционально эквивалентны scnRNAs Tetrahymena, потому что инактивация специфических Dicer- подобных генов у Paramecium супрессирует их образование во время мейоза и устраняет элиминацию транспозонов и находящихся под материнским контролем IESs, а также материнское наследование делеций макронуклеарных генов (V.Serrano et al., неопубликовано).

Оригинальная модель сканирования генома предполагала, что scnRNAs сравниваются с перестроенной ДНК в материнском макронуклеусе, инактивируя те из последовательностей, которые соответствуют макро-нуклеарным последовательностям, и отбирая для пула, специфичного для микронуклеуса (рис. 7.10а). Однако несколько линий доказательств заставляют предполагать. что scnRNAs могут сравниваться с происходящими из макронуклеуса транскриптами, а не с самой ДНК. Это освобождало бы от необходимости открывать ДНК-дуплекс по всему геному, чтобы провести испытание на комплементарность. Те из введенных в материнский макронуклеус Tetrahymena IESs, которые интерферируют с делецией ДНК, транскрибируются, допуская такую возможность (Chalker and Yao, 2001; Chalker et al., 2005). Транскрипты, возникающие с какой-то IES в материнском макронуклеусе, защищали бы зиготическую IES от элиминации, как изначально постулировалось для объяснения IES-подавления у Paramecium, путем титрования гомологичных scnRNAs. Данные в пользу цитоплазматического фактора, который может «спасать» делецию гена А в штамме d48, также говорят в пользу существования протективных транскриптов и позволяют также предполагать что в цитоплазме, как и в материнском макронуклеусе, мог бы происходить отбор scnRNAs Наконец, это объясняло бы, каким образом посттранскрипционный сайленсинг данного гена у Paramecium может вызывать его делецию в следующем поколении: если транскрипты из материнского макронуклеуса разрушаются, 23-нуклеотидные siRNAs, гомологичные scnRNAs, смогут свободно «нацеливать» делеции в новом макронуклеусе, несмотря на присутствие этого гена в материнском макронуклеусе.

Один интересный аспект этой модифицированной гипотезы, которую можно назвать моделью сканирования транскриптома, заключается в том, что все взаимодействия типа образования пар могут происходить между молекулами РНК. Если scnRNAs в конечном счете «нацеливают» формирование гетерохроматина путем взаимодействия с вновь возникающими транскриптами в гомологичном локусе, как это предполагается у S. pombe и растений, эти более поздние взаимодействия по типу образования пар не обязательно должны фундаментально отличаться от взаимодействий, происходящих на этапе селекции. scnRNAs могут просто спариваться с любой доступной РНК после того как они покинут мейотический микронуклеус. Спаривание с многочисленными макронуклеарными транскриптами, присутствующими в клетке на ранних этапах развития, эффективно удаляло бы гомологичные scnRNAs из пула путем их секвестрации или разрушения. К тому времени, когда зиготический макронуклеус формируется и начинает транскрипцию своего неперестроенного генома, для спаривания с образующимися транскриптами оставались бы лишь специфические для микронуклеуса scnRNAs. Эти взаимодействия по типу спаривания могут вести к делеции ДНК, потому что они происходят в развивающемся макронуклеусе или потому, что они происходят на правильной стадии развития.

В этой модели распознавание «своего» (макронуклеарных последовательностей) и «не своего» (геномных паразитов в зародышевой линии) достигается простым онтогенетическим переключением, изменяющим исход простых взаимодействий по типу спаривания. Концептуально это похоже на процесс, посредством которого иммунная система позвоночных научается различать «свое» и «не свое». Изначально генерируется огромный репертуар лимфоцитов, экспрессирующих различные антитела, но на ранних этапах развития все те из них, которые узнают имеющиеся антигены (наиболее вероятно, «свои» антигены), элиминируются из будущего пула. Коль скоро эта стадия пройдена, узнавание сходного антигена (который на этот раз, скорее всего, является чужеродным) ведет к клональному росту соответствующих лимфоцитов. Геномная иммунная система инфузорий, использующая RNAi, обнаруживает, таким образом, поразительный параллелизм с клеточной иммунной системой позвоночных животных.

Рис. 7.10. Модель сканирования транскриптома для сравнения соматического генома и генома зародышевой линии

^{(а) Регулирование «по умолчанию». (1) После начала мейоза большинство или даже все макронуклеарные и микронуклеарные геномы транскрибируются: штриховые линии в макронуклеусе представляют неохарактеризованные транскрипты. В микронуклеусе транскрипция является двунаправленной и приводит к образованию scnRNAs (коротких двунитевых молекул) для последовательностей всех типов (клеточных генов, светлорозовые стрелки: транспозонов, оранжевая двойная стрелка; IES, зеленые прямоугольники). Эти scnRNAs экспортируются в материнский макронуклеус, где они могут спариваться с гомологичными соматическими транскриптами. Спаривание может происходить и в цитоплазме. scnRNAs, спаривающиеся с гомологичными транскриптами, секвестрируются или разрушаются, тогда как scnRNAs, специфичные для микронуклеуса, реэкспортируются в развивающийся зиготический макронуклеус, где они спариваются с гомологичными последовательностями (ДНК или только что образовавшимися транскриптами), «нацеливая» таким образом метилирование по НЗК9 на специфичные для микронуклеуса последовательности (транспозоны и IESs). (4) Маркированные последовательности элиминируются, (б) Эффекты постгранскрипционного сайленсинга гена в материнском макронуклеусе. Экспериментальная индукция постгранскрипционного сайленсинга многокопийными трансгенами или dsRNA приводит к образованию двунитевых siRNAs, гомологичных этому гену (показано красным цветом). Эти siRNAs разрушают гомологичные материнские соматические транскрипты, так что гомологичные scnRNAs не будут инактивированы и смогут «нацеливать» делецию данного гена в развивающемся зиготическом макронуклеусе}

13. Будущий вклад исследований на инфузориях в эпигенетику

Недавнее секвенирование макронуклеарных геномов Tetrahymena и Paramecium сделает эти простые клеточные модели еще более полезными для исследований эпигенетических механизмов. Биология ядерного диморфизма облегчила открытие регуляторов хроматина и останется по-прежнему перспективной системой для новых открытий. Обладая двумя разными путями RNAi — одной, используемой для постгранскрипционного сайленсинга генов, и другой, используемой для эпигенетической модификации генома, — инфузории также уникально сбалансированы для раскрытия сложности направляемых РНК, зависящих от гомологии регуляторных процессов, участвующих в развитии. Рибонуклеазы, родственные Dicer, Argonaute-подобные белки и их партнеры уже идентифицированы или будут идентифицированы, а исследования, ведущиеся в настоящее время, обещают расшифровать их функциональную специализацию. Учитывая филогенетическое положение инфузорий на древе жизни, такая информация без сомнения прольет свет на эволюцию этих механизмов у эукариот.

Именно исследование множественных эпигенетических явлений привело к признанию широкого распространения и использования РНК-опосредованной регуляции у эукариот. Тем не менее, даже до того, как это поняли, наблюдение, что ДНК-содержимое одного ядра оказывает влияние на гомологичные последовательности в другом ядре, заставило исследователей инфузорий постулировать существование Ггая$-активных молекул РНК, направляющих зависимые от гомологии «переговоры». Открытие RNAi и ее роли в перестройках ДНК подтвердило эту спекуляцию. Какие же будущие сведения, имеющие общее значение, могли бы быть получены в результате раскрытия механизмов, опосредующих trans-ядерные «переговоры»?

Если гипотеза «транскрипционного сканирования» (рис. 7.10) верна, материнские соматические транскрипты защищают зиготические ДНК-последовательности от элиминации. Если приравнять элиминацию ДНК формированию гетерохроматина, тогда материнские транскрипты усливали бы, путем блокирования элиминации, эухроматин-специфичные модификации на гомологичных последовательностях. Предполагаемая позитивная роль этих транскриптов на гомологичных генах является, таким образом, непрямой, возникая из их способности инактивировать гомологичные scnRNAs, которые в противном случае «нацеливали» бы формирование гетерохроматина. Тем не менее, этот эффект материнских транскриптов, которые, как заставляют предполагать некоторые эксперименты, не обязательно являются кодирующими белки mRNAs, представлял бы новый механизм, при том, что все известные РНК-опосредованные, зависящие от гомологии механизмы ведут к даун-регуляции гена-«мишени». Деградация или секвестрирование коротких РНК длинными транскриптами является, по существу, оборотной стороной продемонстрированных механизмов, базирующихся на RNAi, где короткие РНК инактивируют длинные.

Если длинные и короткие РНК могут выступать как антагонисты действия друг друга, их взаимодействие должно направлять систему в сторону одного из двух альтернативных состояний, в зависимости от их относительного количества. Это позволяет предполагать, что наследование экспрессионного статуса генов могло бы зависеть от постоянной обратной связи из пула РНК, а не исключительно от механизмов полуконсервативной репликации хроматина. Соблазнительно думать, что такой опосредованный РНК, trans-активный механизм ответствен за стабильность экспрессии генов поверхностных антигенов в ходе вегетативного роста у Paramecium, потому что это объясняло бы также, каким образом, после полового воспроизведения, развивающийся макронуклеус может наследовать материнский серотип через цитоплазму. Таким образом, эпигенетическое наследование паттернов геномных перестроек может быть лишь частным аспектом всеобъемлющей системы наследования у инфузорий, базирующейся на РНК.

По мере того, как будущие исследования на инфузориях будут высвечивать опосредующих такую регуляцию игроков (РНК и белки), должно будет выявляться ее существование у других организмов и ее дальнейшая связь с известными эпигенетическими механизмами. Вполне вероятно, что базирующаяся на РНК наследственность, в ее базовой форме, широко распространена. Недавние исследования транскриптомного выхода у многоклеточных организмов обнаружили неожиданное обилие и сложность некодирующих транскриптов (Mattick, 2004; Meyers et al., 2004; Suzuki and Hayashizaki, 2004; Cheng et al., 2005; Claverie, 2005), а также частую встречаемость коротких РНК, совпадающих по последовательности с геномными районами всех типов (Lu et al., 2005). Многие зависимые от гомологии эффекты, в том числе мейотический сайленсинг у грибов и парамутация у растений (главы 6 и 9), остаются не до конца понятыми. Только комплексная картина, которая будет получена в будущих экспериментах на всех эукариотах, включая инфузорий, даст нам полное представление об эпигенетических процессах.

Литература

Allis C.D. and Gorovsky M.A. 1981. Histone phosphorylation in macro- and micronuclei of Tetrahymena thermophila. Biochemistry 20: 3828-3833.

Allis C.D., Glover C.V., Bowen J.K., and Gorovsky M.A. 1980. Histone variants specific to the transcriptionally active, amitotically dividing macronucleus of the unicellular eucaryote, Tetrahymena thermophila. Cell 20: 609-617.

Beisson J. and Sonnebom T.M. 1965. Cytoplasmic inheritance of the organization of the cell cortex in Paramecium aurelia. Proc. Natl. Acad. Sci. 53: 275-282.

Beisson J. and Wright M. 2003. Basal body/centriole assembly and continuity. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 96-104.

Betermier M. 2004. Large-scale genome remodelling by the devel-opmentally programmed elimination of germ line sequences in the ciliate Paramecium. Res. Microbiol. 155: 399-408.

Betermier M., Duharcourt S., Seitz H., and Meyer E. 2000. Timing of developmentally programmed excision and circularization of Paramecium internal eliminated sequences. Mol. Cell. Biol. 20: 1553-1561.

Brownell J.E. and Allis C.D. 1995. An activity gel assay detects a single, catalytically active histone acetyltransferase subunit in Tetrahymena macronuclei. Proc. Natl. Acad. Sci.A 92: 6364-6368.

Brownell J.E., Zhou J., Ranalli T, Kobayashi R., Edmondson D.G., Roth S.Y., and Allis C.D. 1996. Tetrahymena histone acetyltransferase: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851.