Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 7.7. Эпигенетическое наследование и экспериментальное «спасение» делеций макронуклеарного гена А

^{(а) Штамм дикого типа. (б) У штамма d48 нет гена А в его макронуклеусе, но его микронуклеус — дикого типа. Ген А воспроизводимо делетируется в ходе развития макронуклеуса в каждом поколении, (в) Трансформация макронуклеуса штамма d48 последовательностями гена А специфически восстанавливает амплификацию гена А зародышевой линии в развивающемся макронуклеусе полового потомства}

10.2. Эпигенетическое наследование экспериментально индуцированных делеций

Материнское влияние на перестройки ДНК. подобное тому, как это наблюдалось для d48, по-видимому контролирует развитие многих, а возможно и всех, районов макронуклеарного генома Paramecium. В самом деле, макронуклеарные делеции, создаваемые экспериментально в половом потомстве, могут «спонтанно» воспроизводиться в последующих половых поколениях, по материнскому типу наследования. Это наблюдали и для делеций гена G, индуцированных у Pprimaurelia высококопийным трансгеном, для другого субтеломерного гена поверхностного антигена (Меуег, 1992), и для макронуклеарных делеций гена ND7, которые превоначально были индуцированы скармливанием dsRNA (Gamier et al., 2004). В любом случае индуцирующий трансген или введенная dsRNA не были больше необходимыми для воспроизведения данной делеции в половом потомстве. У d48 и в этих индуцированных вариантных клеточных линиях данное состояние соматического генома может время от времени после автогамии ревертировать к перестроечному паттерну дикого типа, подтверждая тем самым, что этот ген все еще наличествует в микронуклеарном геноме, и высвечивая эпигенетический способ наследования.

Замечательно, что сайленсинг гена и подучающаяся в результате делеция ДНК могут «запоминаться» в последующих поколениях; при этом целевой геномный район обрабатывается в ходе развития макронуклеуса так же, как транспозоны и IESs. Рекуррентная делеция гена в каждом половом поколении, по-видимому, не индуцируется ~23-нуклеотидными siRNAs, поскольку эти РНК выявлялись лишь тогда, когда сайленсинг экспериментально индуцируется в первом поколении. Более того, генетический анализ таких клеточных линий показал, что этот микронуклеарный ген не несет никакого постоянного импринта, поскольку он может нормально амплифицироваться в ходе макронуклеарного развития, когда он переносится при конъюгации в клеточную линию с макронуклеусом дикого типа. Создается, следовательно, впечатление, что этот ген делегируется в развивающемся макронуклеусе просто потому, что он отсутствует в материнском макронуклеусе.

10.3. «Спонтанная» элиминация чужеродных последовательностей, интродуцированных в микронуклеарный геном

Воспроизведение материнских перестроечных состояний позволяет предполагать, что геном зародышевой линии, которому предстоит реорганизация, сравнивается с существующим перестроенным геномом, и последовательности, отсутствовавшие в предшествующем поколении, делаются целевыми для удаления из вновь формирующегося соматического генома. Если бы это действительно было так, то можно было бы предсказать, что трансгены, интродунируемые в микронуклеус зародышевой линии, часто делегировались бы в ходе развития нового макронуклеуса. У Tetrahymena, где была разработана трансформация микронуклеуса, исследователи наблюдали, что интегрированные маркеры лекарственной устойчивости, используемые для исследований с дизрупцией генов, могут делегироваться из макронуклеарного генома в ходе последовательных раундов конъюгации (Yao et al., 2003; Liu et al., 2005). Геномная локализация трансгена, а также число копий, вводимых в геном зародышевой линии, существенно влияли на эффективность элиминации (Liu et al., 2005), что указывает на то, что индукция данного явления у этой инфузории носит менее общий характер. Тем не менее, эти результаты демонстрируют, что чужеродная последовательность, бактериальный неоген, может распознаваться клеткой как IES.

10.4. Экспериментальное «спасение» наследуемых макронуклеарных делеций

Является ли простое отсутствие некоего геномного района в материнском соматическом макронуклеусе достаточным для направления его будущей элиминации? Если это так, тогда повторное введение гена А в макронуклеус d48 должно было бы «спасать» этот дефект в воспроизведении гена А в ходе развития. Сначала было показано, что инъекция либо макронуклеоплазмы дикого типа в вегетативный макронуклеус d48 (Harumoto, 1986), либо цитоплазмы от автогамных клеток дикого типа в клетки d48 в раннем развития (Koizumi and Kobayashi, 1989) приводили к перманентной реверсии d48 к дикому типу. Впоследствии прямая микроинъекция нескольких неперекрывающихся фрагментов гена >4, распространяющихся на большую часть ~8-тн кодирующей последовательности, в макронуклеус d48 продемонстрировала, что последовательность гена А сама по себе достаточна для восстановления макронуклеарного перестроечного паттерна дикого типа (рис. 7) (Koizumi and Kobayashi, 1989; Jessop-Murray et al., 1991; You et al., 1991).

Влияние материнского генома на перестройки ДНК показывает заметную специфичность по последовательности. Кодирующие последовательности генов А и В в целом идентичны на 74 %. Тем не менее, инъекция последовательностей гена А в макронуклеус клеточной линии, несущей макронуклеарные делеции обоих генов, могла лишь предотвращать делению гена А из нового макронуклеуса; и сходным же образом, инъекция гена В могла лишь препятствовать своей собственной делеции (Scott et al., 1994). Кроме того, макронуклеарную делецию d48 нельзя было «спасти» трансформацией геном G от P.primaurelia, на 78 % идентичным с геном А. С другой стороны, макронуклеарная делеция гена А могла быть «спасена» трансформацией другой аллелью гена Л, демонстрирующей 97%-ную идентичность (Forney et al., 1996). Таким образом, материнское «спасение» макронуклеарных делеций является зависящим от гомологии процессом, который не нуждается в какой-либо специфической последовательности внутри генов, но требует некоего минимального уровня идентичности последовательностей.

Этот материнский эффект «спасения» d48, на первый взгляд, выглядит как не согласующийся с индуцированными трансгеном делециями, поскольку в этих экспериментах инъекция последовательностей гена А в материнский макронуклеус имела в точности противоположные последовательности в зиготическом гене А. Этот кажущийся парадокс был разрешен, когда было показано, что постзиготический эффект делеций зависит от установления зависяшего от гомологии сайленсинга в трансформированных клонах (Gamier et al., 2004). Наоборот, эффект «спасения» наблюдается лишь в условиях трансформации, которые не вызывают сайленсинга (т.е. лишь умеренные числа копий для неэкспрессируемых конструктов или любое число копий для экспрессируемых трансгенов) (Gamier et al., 2004). Таким образом, оказывается, что накопление ~23-нуклеотидных siRNA может предотвратить эффект «спасения» последовательностей гена А в материнском макронуклеусе, который стимулирует амплификацию гена А в развивающемся макронуклеусе. Это является сильным доводом в пользу того, что цитоплазматическим фактором, опосредующим транс-ядерный эффект, является транскрипт гена А. Однако это не обязательно должна быть полноразмерная mRNA, потому что даже фрагменты кодирующей последовательности обладают, как было показано, «спасающей» активностью. Более того, клоны, содержащие целый ген, часто экспрессируют эту mRNA на протяжении всего вегетативного роста, тогда как продукция «спасающего» цитоплазматического фактора ограничена, как было показано, периодом ядерной реорганизации.

10.5. Экспериментальное подавление элиминации IES в развивающемся макронуклеусе

Если делеция или сохранение клеточных генов контролируются путем сравнения содержания соматического генома и генома зародышевой линии, тогда даже эффективная в норме эксцизия IESs могла бы, возможно, нарушаться, когда копии присутствуют в материнском макронуклеусе. Изучение менделевской мутации, mtFE, обладающей плейотропными влияниями на развитие макронуклеуса, в том числе влиянием на детерминацию типа спаривания (Brygoo and Keller, 1981a,b), дало возможность проверить это предсказание. Оказалось, что эта мутация, будучи в гомозиготном состоянии, отменяет вырезание IES-последовательности, локализованной в гене поверхностного антигена G. Удивительно, но когда аллель дикого типа гена mtF была реинтродуцирована в мутантный штамм в результате конъюгации, эта IES все еще не вырезалась в ходе последующего развития макронуклеуса (Meyer and Keller, 1996). Генетический анализ получившегося в результате вариантного штамма, названного штамм IES4, подтвердил, что генетически он является диким типом и что специфическое сохранение этой IES наследуется по материнской линии в половом потомстве (Duharcourt et al., 1995).

Является ли эксцизия IES в развивающихся макронуклеусах индуцированной материнскими копиями корректно перестроенного гена G или же ингибированной материнскими копиями сохраняющего IES гена G?

Чтобы ответить на этот вопрос, макронуклеусы клеток 1ES+ или IES были трансформированы с помощью прямой микроинъекции плазмид, содержащих фрагмент кодирующей последовательности G в ее микронуклеарной (IES+) или макронуклеарной (IES ) версиях (рис. 7.8) (Duharcourt et al., 1995). После автогамии трансформированные клоны, содержавшие плазмиду IES", дали линии потомков, которые сохранили IES в своих вновь сформировавшихся макронуклеусах, тогда как клетки IES+, трансформированные плазмидой IES", оказались неспособными индуцировать эксцизию, и их потомство оставалось в состоянии IES+. Плазмида, содержавшая только IES, без каких-либо фланкирующих последовательностей, также вызывала сохранение IES, показывая тем самым, что одни только материнские копии IES подавляют эксцизию из материнских макронуклеусов (Duharcourt et al., 1995).

Может ли вырезание других IESs контролироваться подобными материнскими влияниями? Для ответа на этот вопрос макронуклеусы клеток дикого типа трансформировали большими сегментами микронуклеарной ДНК (IES+), содержащими гены поверхностных антигенов либо G, либо A (Duharcourt et al., 1998). Эти инъецированные сегменты содержали, соответственно, шесть и девять IESs. Изучали эксцизию 13 из этих IESs, и оказалось, что пять IESs сохранялись в макронуклеусах поставтогамных потомков этих трансформированных клеток. Инъекция плазмид, содержащих одиночные IESs, показала, что подавление было строго специфичным: каждая из этих пять IESs индуцировала сохранение только гомологичной зиготической IES, но не влияла на какие-либо другие. Контрольный фрагмент ДНК, содержавший большую часть макронуклеарного (IES) гена (7, не оказывал никакого влияния на любую из тестируемых IESs. Среди 13 испытанных IESs Paramecium не было сколько-нибудь очевидных различий в величине, составе оснований или в положении внутри генов между этими пятью, которые продемонстрировали материнский эффект, и восьмью, которые его не обнаружили (Duharcourt et al., 1998).

Эксперименты, аналогичные проведенным на Paramecium, показали, что содержание ДНК родительского макронуклеуса Tetrahymena может регулировать элиминацию гомологичных последовательностей из развивающегося соматического генома Две хорошо охарактеризованные IESs, делеционные элементы М и R, были введены путем микроинъекций в макронуклеусы штаммов дикого типа таким образом, что они поддерживались на высококопийных векторах. Когда у этих клеток была индуцирована конъюгация, потомство клеток, содержащих материнские копии элемента М, оказалось неспособным эффективно элиминировать соответствующие IESs во время развития макронуклеуса (Chalker and

Yao, 1996). Подобным же образом клетки, родительские макронуклеусы которых содержали копии элемента R, оказались неспособными вырезать гомологичную IES. Существенное подавление эксцизии негомологичных элементов не наблюдали. Таким образом, подавление элиминации ДНК было специфичным в отношении последовательности. Последовательности, гомологичные самой IES, были достаточны для этого подавления, а непосредственно фланкирующие ДНК таким эффектом не обладали. Важно отметить, что эта индуцированная неспособность к элиминации ДНК была наследуемой, поскольку последующие поколения также сохраняли геномные копии этой IES в своих макронуклеусах.

Поскольку у Tetrahymena в конъюгирующих парах во время развития происходит интенсивный обмен цитоплазмой, исследователи имели возможность наблюдать, что это подавление передавалось через цитоплазму таким образом, что лишь один из партнеров должен был нести эту IES в своем родительском соматическом геноме для того, чтобы были затронуты гомологичные последовательности во всех развивающихся ядрах в паре, включая ядра в партнере дикого типа. Следовательно, состояние перестройки ДНК, характерное для родительских ядер, передается через цитоплазму и регулирует события, происходящие во время формирования нового соматического генома следующего поколения. Никакого обмена ядрами зародышевой линии не требуется для передачи состояния одного партнера по спариванию другому; это наблюдение исключает возможность того, что передача происходит путем наложения импринта на зародышевую линию в ходе нормального клеточного роста до вступления в развитие (Chalker et al., 2005). Действительно, путем физического разделения конъюгирующих пар, состоящих из клетки дикого типа и ее партнера, содержавшего копии элемента М в своем материнском соматическом ядре, было показано, что передача происходит после мейоза и очень близко к тому моменту, когда развивающиеся ядра впервые начинают дифференцироваться в новые макронуклеусы и микронуклеусы. Следовательно, влияние материнского соматического генома активно устанавливается в ходе развития.

Способность инфузорий изменять перестройки ДНК таким образом, чтобы отражать материнский паттерн, дает клеткам простой способ передавать альтернативные соматические версии генома половому потомству. Эта динамическая регуляция означает, что стабильное равновесие между двумя альтернативными генетическими состояниями, например IES+(100 % эксцизии) и IES(0 % эксцизии) может достигаться и поддерживаться на протяжении многих половых поколений. Это было показано по крайней мере для одной IES Paramecium, для которой такое материнское влияние достаточно для того, чтобы превратить меньшую долю макронуклеарных копий IES+ в большую фракцию в макронуклеусе следующего поколения (Duharcourt et al., 1995). Такое влияние параллельно стабильному, материнскому наследованию типов спаривания О и Еу P.tetraurelia. Сопоставимая асимметрия обнаруживается в обеих системах, потому что и эксцизия IES, и детерминация О-типа, по-видимому, являются путями развития «по умолчанию», тогда как и сохранение IES, и детерминация Е-типа нуждаются в некоем цитоплазматическом сигнале из материнского макронуклеуса для изменения этих своих путей развития. Эти системы вполне могут быть родственными, потому что менделевская мутация mtFE, нарушающая эксцизию одной IES гена G независимо от родительского состояния, сходным образом делает детерминацию к Е конститутивной — наблюдение, связывающее альтернативные состояния обоих примеров. Выяснение механизма (механизмов), лежащего в основе этих явлений, несомненно вскроет новые способы материнского наследования эпигенетической информации.

Рис. 7.8. Зависимое от гомологии подавление эксцизии IES материнским макронуклеусом

^{В ходе нормального развития IESs (красные и зеленые прямоугольники) эффективно вырезаются. Однако трансформация материнского макронуклеуса данной IES (исходные трансформанты = поколение t) может подавить элиминацию гомологичной IES во время последующих (поколение t + 1) (b будущих) раундов дифференцировки нового макронуклеуса}

11. Trans-нуклеарное сравнение целых геномов, опосредованное РНК-интерференцией

Зависящие от гомологии эффекты, описанные выше, демонстрируют существование «переговоров» [a cross talk] между материнским соматическим геномом и геномом зародышевой линии в процессе ядерной дифференцировки, которые могут существенным образом менять паттерны перестройки ДНК. Тот факт, что затрагиваются только высоко гомологичные последовательности, является сильным аргументом в пользу предположения, что эти «переговоры» опосредуются нуклеиновыми кислотами. В этом регуляторном механизме могли бы, возможно, участвовать транскрипты из материнского макронуклеуса, экспортируемые в развивающийся макронуклеус, где, в случае, если они содержат IES, они предотвращали бы элиминацию гомологичных последовательностей. Однако было показано, что эти предполагаемые материнские транскрипты не участвуют в качестве донорских матриц в ходе репарации двунитевых разрывов, индуцируемых конститутивной эксцизией IES (Duharcourt et al., 1995). Если материнские защитные транскрипты существуют, эти ~23-нуклеотидные siRNAs, которые диктуют сайленсинг генов, могут косвенным образом «нацеливать» делецию ДНК, стимулируя разрушение тех из них, которые идентичны по последовательности. Сама по себе эта роль siRNAs не может объяснить материнское наследование перестроечных паттернов в последовательных поколениях. Как это обсуждается ниже, возможно, что в конечном счете реорганизацией генома управляет взаимодействие между материнскими макронуклеарными транскриптами и новым классом коротких РНК, происходящих из мейотического микронуклеуса.

11.1. Связь коротких РНК с элиминацией ДНК

У Tetrahymena каноническая модификация гетерохроматина, H3K9-метилирование, маркирует хроматин, связанный с IESs, непосредственно перед их вырезанием. Каким образом эта модификация осуществляет специфическое «нацеливание» на эти сегменты ДНК, предназначенные для элиминации? Был описан RNAi-подобный путь, который использует RNA-гиды, чтобы направить ее на соответствующие локусы (обзор см. Mochizuki and GorovskY, 2004; Yao and Chao, 2005). Первоначальным указанием на то, что делеция ДНК использует молекулы гомологичных РНК, явилось наблюдение, что у Tetrahymena IESs двунаправлено транскрибируются на ранних этапах конъюгации (Chalker and Yao, 2001). Реальный прорыв случился, когда Mochizuki и др. (2002) идентифицировали белок семейства PIWI/Argonaute, кодируемый геном TWI1, который экспрессируется в ходе развития и необходим для перестройки ДНК (Mochizuki et al., 2002) Поскольку белки Argonaute являются ключевыми игроками в процессах, включаемых RNAi, эти исследователи искали и нашли такой класс эндогенных малых (-28 нуклеотидов) РНК, которые предпочтительно комплементарны к последовательностям, ограниченным зародышевой линией. Деструкция гена TWI1 дестабилизировала эти короткие РНК и ликвидировала метилирование H3K9 в развивющемся соматическом ядре. Эта работа, опубликованная в 2002 году, в совокупности с экспериментами на Schizosaccharomyces pombe (главы 6 и 8) утвердила новую парадигму, согласно которой

гетерохроматин генерируется действием гомологичных РНК, «нацеливающих» метку сайленсинга (H3K9) на специфичные локусы.

Характеристика гена DCLl, кодирующего рибонуклеазу Dicer, осуществляющую процессинг двусторонних транскриптов в ~28-нуклеотидные малые РНК, обеспечила еще более глубокое проникновение в общую регуляцию этого процесса (Malone et al., 2005; Mochizuki and Gorovsky, 2005). Этот белок экспрессируется на высоком уровне на ранних этапах конъюгации и локализуется в премейотических микронуклеусах, что указывает на то, что генерация малых РНК компартментализована во времени и пространстве в пределах этого ядра зародышевого пути. Разрушение гена DCL1 вызывало утрату способности производить малые РНК, аккумуляцию транскриптов зародышевой линии и, в конечном счете, неспособность к вырезанию IES. Интригующим моментом является то, что утрата малых РНК не ликвидирует метилирование H3K9, как это наблюдалось в линиях с нокаутом по TWI1. Тем не менее, анализ с помощью иммунопреципитации хроматина показал, что эта модификация больше не является обогащенной на IESs; таким образом, малые РНК необходимы для того, чтобы «нацеливать» эту модификацию хроматина на нужные локусы (Malone et al., 2005).

Чтобы объяснить роль материнского генома в регуляции этих событий, была предложена модель сканирующей РНК (Mochizuki et al., 2002). В варианте этой модели, изображенном на рис. 7.9, 28-нуклеотидные «сканирующие» РНК, генерируемые в микронуклеусе, - связываются с RISC-подобным комплексом в цитоплазме, содержащим Twil, и изначально направляются в материнский макронуклеус. Здесь они сканируют существующий перестроенный геном на наличие гомологии. Те scnRNAs, которые спариваются с материнскими последовательностями, удаляются из пула активных комплексов. Остающиеся scnRNAs, ассоциированные с Twil, транспортируются затем в развивающийся макронуклеус, где они «нацеливают» метилирование H3K9 на гомологичные последовательности, маркируя их для вырезания с помощью механизма перестройки ДНК. Эта модель подкрепляется далее наблюдением, согласно которому Twil локализуется в материнском макронуклеусе на ранних этапах развития после образования основной массы малых РНК, но до появления предшественников новых макронуклеусов. Таким образом, регулируемый трафик комплексов малых РНК и белков облегчает сравнение соматического генома и генома зародышевой линии.