Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Yao M.C, Duharcourt S., and Chalker D.L. 2002. Genome-wide rearrangements of DNA in ciliates. in Mobile DNA IJ (ed. A. Lambowitz), pp. 730-758. Academic Press, New York.

Yao M.C., Fuller P., and Xi X. 2003. Programmed DNA deletion as an RNA-guided system of genome defense. Science 300: 1581-1584.

You Y., Aufderheide K., Morand J., Rodkey K., and Forney J. 1991. Macronuclear transformation with specific DNA fragments controls the content of the new macronuclear genome in Paramecium tetraurelia. Mol. Cell Biol. 11: 1133-1137.

Yu L. and Gorovsky M.A. 1997. Constitutive expression, not a particular primary sequence, is the important feature of the H3 replacement variant hv2 in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 17: 6303-6310.

Глава 8. RNAi и сборка гетерохроматина

Robert Martiensser¹ и Danesh Moazed²

1Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 11724

2Departament of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115-5730

Общее резюме

Пересечение РНК-интерференции (RNAi) и формирования гетерохроматина свело вместе две области регуляции генов, которые, как считалось прежде, используют разные, возможно даже неродственные механизмы. На основе цитологических методов окрашивания гетерохроматин был первоначально определен — почти 80 лет тому назад — как те районы хромосом, которые сохраняют конденсированное состояние на протяжении всего клеточного цикла. Ранние исследователи, изучавшие взаимоотношения между структурой хромосом и экспрессией генов, заметили, что некоторые хромосомные перестройки приводят к распространению гетерохроматина на соседние гены, которые затем становятся «молчащими». Но стохастическая природа такого распространения давала начало генетически идентичным популяциям клеток, которые имели разные фенотипы, давая тем самым поразительный пример эпигенетической регуляции. Термин «RNAi» был впервые использован для описания сайленсинга генов, когда нематоде Caenorhabditis elegans вводили гомологичную антисмысловую или двунитчатую РНК (dsRNA). Вскоре выяснили, что аналогичный механизм объясняет посттранскрипционный сайленсинг трансгена (PTGS — posttranscriptional transgene silencing), описанный ранее у петунии и других растений. Напротив, согласно широко распространенному мнению, гетерохроматин действует непосредственно на уровне хроматина, вызывая репрессию транскрипции с помощью механизма, называемого транскрипционным сайленсингом генов (TGS — transcriptional gene silencing). В этой главе мы сосредоточим наше внимание на взаимоотношениях между механизмом RNAi и формированием эпигенетически наследуемого гетерохроматина в специфических хромосомных районах. Мы воспользуемся недавними примерами, демонстрирующими эти отношения у дробянковых дрожжей Schizosaccharomyces pombe и растения Arabidopsis thaliana [резушка Таля].

Ядерный геном дробянковых дрожжей состоит из трех хромосом величиной от 3,5 до 5,7 млн. о. Каждая хромосома содержит, особенно в центромерах, большие блоки повторяющейся ДНК упакованные в гетерохроматин. Кроме того, локусы типа спаривания (контролирующие тип клетки) и субтеломерные участки ДНК также содержат повторяющиеся последовательности, упакованные в гетерохроматин. Мы знаем теперь, что сборка ДНК в гетерохроматин играет и регуляторную, и структурную роль. В случае локусов типа спаривания у дрожжей регуляция генной транскрипции гетерохроматином важна для идентичности клеточного типа. В случае теломер и центромер гетерохроматин играет структурную роль, которая важна для правильного расхождения хромосом в ходе клеточного деления. Более того, повторяющиеся последовательности ДНК и перемещающиеся элементы составляют большую долю (в некоторых случаях более половины) генома многих эукариотных клеток. Гетерохроматин и связанные с ним механизмы играют ключевую роль в поддержании стабильности генома, регулируя активность повторяющихся последовательностей. Недавние исследования вскрыли удивительную потребность в компонентах RNAi-пути для процесса образования гетерохроматина у дробянковых дрожжей и позволили выяснить, каким образом эти два пути могут работать совместно на уровне хроматина. Говоря коротко, молекулы малых интерферирующих РНК (siRNA), являющиеся сигнатурами RNAi и других механизмов сайленсинга на основе dsRNA, собираются в комплекс индуцируемого РНК транскрипционного сайленсинга (RITS — RNA-Induced Transcriptional Silencing) и «направляют» эпигенетические модификации хроматина и формирование гетерохроматина в комплементарных участках хромосом. RITS использует зависимое от siRNA спаривание оснований для того, чтобы направлять ассоциацию либо с ДНК, либо с последовательностью вновь синтезируемой РНК в локусе-мишени, который должен быть сайленсирован, — ассоциацию, которая стабилизируется непосредственным связыванием с метилированным гистоном H3. Присутствие этих двух активностей в RITS включает формирование гетерохроматина совместно с хорошо известными, ассоциированными с гетерохроматином факторами и непосредственно связывает РНК-сайленсинг с модификацией гетерохроматина.

У A. thaliana и других эукариот (за исключением Saccharomyces cerevisiae) участки центромерной ДНК также состоят из повторяющихся элементов. Эти и другие повторяющиеся последовательности, такие как ретроэлементы и другие транспозоны, являются источниками siRNAs, привлекая метилирование H3K9 и ДНК. Здесь, опять-таки, несколько компонентов пути RNAi необходимы для инициации и поддержания этих событий репрессивного метилирования. В этой главе мы обсуждаем, как образуются гетерохроматиновые siRNAs и как они опосредуют модификации ДНК и (или) хроматина у дробянковых дрожжей и A. thaliana.

1. Обзор RNAi-пути

Хотя термин «RNAi» первоначально использовался для описания сайленсинга, который опосредуется экзогенной dsRNA у С. elegans (Fire et al., 1998), сейчас он в широком плане обозначает сайленсинг генов, включаемый dsRNA того или иного рода. Этапы RNAi включают образование dsRNA (которая может быть эндогенной или экзогенной, как, например, вирусная РНК), её процессинг в siRNA и «нацеливание» этих молекул либо на hRNAs (PTGS), либо на участки хроматина (TGS), чтобы вызвать сайленсинг. Поэтому, прежде чем представить компоненты механизма RNAi, специфичные для TGS, мы обсудим источник dsRNA, запускающих механизм RNAi.

dsRNA могут образовываться в результате двунаправленной транскрипции повторяющихся элементов ДНК или транскрипции молекул РНК, спсобных к спариванию оснований внутри себя с образованием сегментов dsRNA (рис. 8.1, а и б, соответственно) Например, транскрипция с участков инвертированных повторов дает молекулы РНК, складывающиеся сами на себя с образованием шпилечных структур. Затем dsRNA расщепляются ферментом Dicer — рибонуклеазой класса RNase III, которая генерирует siRNAs. siRNAs — это комплементарные дуплексы величиной 21—27 нуклеотидов, обладающие характерным «свисающим концом» [overhang] длиной 2 нуклеотида на каждом 3’-конце дуплекса (Hamilton and Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000; Bernstein et al., 2001; Elbashir et al., 2001: Hannon. 2002; Zamore, 2002; Bartel, 2004; Baulcombe, 2004). Эти дуплексы раскручиваются в однонитевые siRNAs, которые действуют как «проводники», взаимодействуя на основе спаривания оснований с комплементарными последовательностями-мишенями. Они являются, следовательно, факторами специфичности и играют центральную роль во всех механизмах сайленсинга, опосредованных RNAi.

На данный момент идентифицированы два родственных комплекса, включающие siRNA: RISC и RITS. В комплексе RISC (RNA-Induced Silencing Complex) siRNAs распознают nRNAs-«мишени» и инициируют их деградацию путем эндонуклеолитического расщепления в пределах участка nRNA, спаренного с siRNA (Hannon, 2002; Bartel, 2004). Этот первоначальный акт расщепления выполняет PHКаза-Н-домен белка семейства Argonaute/PIWI (субъединица RISC). В ядерном комплексе RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), сходном с RISC, siRNAs «нацеливают» этот комплекс на хромосомные участки для модификации хроматина (Verdel et al., 2004; Buhler et al., 2006). Это и есть RITS-опосредованный РНК-путь — центральная тема этой главы.

Рис. 8.1. Источники dsRNA, являющихся субстратом для образования siRNAs рибонуклеазой Dicer и триггером РНК-сайленсинга

^{(а) У S. pombe двунаправленную транскрипцию наблюдали в центромерных районах и районе cenH «молчащего» локуса типа спаривания. (б) Транскрипция инвертированных повторов, обнаруживаемых в клетках многих растений и животных, потенциально может производить dsRNA. (в) Транскрипция аберрантных РНК, которые могут не иметь соответствующих сигналов процессинга, может включать синтез dsRNA с помощью RdRPs}

Для механизма РНК-сайленсинга дополнительного типа с участием микроРНК (miRNA) требуются ключевые белки Argonaute и Dicer. HYR, транскрибированная с эндогенных некодирующих генов и исходно образующая шпилечные РНК-структуры благодаря растянутым dsRNA-участкам, в несколько этапов процессируется в miRNA (Bartel, 2004; Filipowiicz et al., 2005). Подобно siRNAs, miRNAs имеют размеры 21—24 нуклеотида и образуют часть RISC через посредство белков Argonaute для «нацеливания» на специфические иРНК. Результатом этого «нацеливания» может быть расщепление посредством PIWI/RNaseH-домена и репрессия трансляции, включая взаимодействия с кэпом 7meG на 5’-конце иРНК. Это может сочетаться с секвестрированием иРНК в цитоплазматических РНК-процессирующих органеллах, известных как Р-тельца (Processing bodies). Таким образом, к образованию siRNA или miRNA приводят по крайней мере два разных пути процессинга dsRNA; тем не менее, эти РНК используют сходные средства для инактивации сходных иРНК. Путь miRNA отличается, поскольку все miRNAs производятся эндогенными некодирующими генами, которые в основном регулируются процессами развития и, в свою очередь, обычно «нацеливают» и регулируют в развитии сайленсинг гомологичных генов.

Хотя dsRNAs могут образовываться путем отжига прямонаправленной и инверсной РНК, получающихся в результате двунаправленной транскрипции, или присутствуют в виде шпилечных структур, в некоторых клетках для RNAi требуется дополнительный энзим для образования dsRNA. Этот фермент — РНК-направляемая РНК-полимераза (RdRP), обнаруженная у растений и у С. elegans (Dalmay et al., 2000; Sijen et al., 2001). Он использует siRNAs в качестве праймеров для генерации большого количества dsRNA, которые затем могут процессироваться Dicer в дополнительные siRNA. Таким образом, считается, что первичная функция RdRP — амплификация RNAi-ответа, но, как мы обсудим позже, RdRP может играть и более специфическую роль в инициации синтеза dsRNA (раздел 5). Действительно, она, по-видимому, участвует в процессе, приспособленном для формирования лучшей защитной реакции хозяина в ответ на введение экзогенной dsRNA. Эта идея подкрепляется тем фактом, что RdRPs не являются участниками путей сайленсинга с помощью miRNA (Sijen et al., 2001). Интересно, что в геномах насекомых (в том числе Drosophila) и позвоночных (включая млекопитающих) отсутствуют распознаваемые RdRP-подобные последовательности, но остается возможность, что у этих организмов синтез dsRNA выполняют другие полимеразы.

Какова же тогда функция этих разнообразных механизмов РНК-сайленсинга? Они весьма консервативны у широкого круга организмов, от дробянковых дрожжей и растений до человека, и они играют центральные роли в регуляции экспрессии генов и стабильности генома (через формирование стабильного гетерохроматина в центромерах и теломерах). Кроме того, эти механизмы сайленсинга принимают участие в защите против транспозонов и РНК-вирусов путем разрушения их РНК-транскриптов (Plasterk, 2002; Li and Ding, 2005). Наконец, транскрипция с некоторых транспозонов приводит к образованию аберрантных РНК, включающих RNAi с помощью механизма, конвертирующего, как полагают, аберрантные транскрипты в dsRNA с помощью RdRPs (рис. 8.1) (Baulcombe, 2004).

2. Ранние данные, позволяющие предполагать, что РНК является посредником в транскрипционном сайленсинге

Прежде чем обсуждать лучше изученные примеры модификаций хроматина, базирующихся на RNAi, у дробянковых дрожжей и Arabidopsis, мы кратко рассмотрим ранние эксперименты, предполагающие участие РНК как посредника в модификациях хроматина и ДНК. Самое раннее свидетельство роли РНК как промежуточного звена в TGS было получено в исследованиях вироидов растений. Вироид веретеновидности клубней у картофеля (PSTV—potato spindle tuber viroid) состоит из РНК-генома величиной 359 nt и реплицируется по механизму РНК-РНК. Введение PSTV в геном табака приводит к метилированию ДНК гомологичных ядерных последовательностей, хотя и трансгенных по происхождению (Wassenegger et al., 1994). Однако эти и интегрированные копии ДНК PSTV становятся метилированными только у растений, которые поддерживают транскрипцию вироидной РНК, что заставляет предполагать участие PHК-посредника, «направляющего» метилирование ДНК (Wassenegger et al., 1994). Далее, у Arabidopsis производство аберрантных транскриптов каким-то образом приводит к метилированию ДНК всех гомологичных промоторных участков и к транскрипционному сайленсингу генов (Mette et al., 1999). Этот факт, вместе с открытием, что репликация вирусных геномов у растений ведет к образованию малых РНК размером 22 нуклеотида, позволяет предполагать, что механизмы, родственные RNAi, опосредуют метилирование ДНК (Mette et al., 2000). Эти наблюдения, а также индуцированный повторами сайленсинг, вызываемый трансгенами, который впервые был обнаружен у петунии и у табака, сейчас широко признаны как самые ранние примеры сайленсинга с помощью RNAi (Napoli et al., 1990; обсуждается в главе 9).

Дальнейшие доказательства связи между RNAi и TGS были получены на Drosophila в исследованиях сайленсинга генов, индуцируемого повторами (глава 5). Введение множественных тандемных копий трансгена приводит к сайленсингу как этого трансгена, так и эндогенных копий (Pal-Bhadra et al., 1999). Этот сайленсинг нуждается в хромосомном белке Polycomb, который также участвует в упаковке гомеотических регуляторных генов в подобные гетерохроматину структуры за пределами их собственных доменов действия (Francis and Kingston, 2001). Кроме того, для этого индуцируемого повторами сайленсинга генов требуется Piwi — свойственный Drosophila член семейства Argonaute, необходимый для RNAi (Pal-Bhadra et al., 2002). У Tetrahymena другой член белкового семейства Piwi, Twil, необходим для накопления малых PFIK и массивной элиминации ДНК, наблюдающейся в соматических ядрах простейших (глава 7). Эти и более поздние результаты, обсуждаемые в разделе 8. позволяют предполагать, что RNAi-путь участвует в сборке структур репрессивного хроматина у мух.

Другие механизмы сайленсинга, индуцируемого повторами, описаны у нитчатых грибов; сюда относятся индуцируемые повторами точечные мутации (RIP — Repeat Induced Point mutation) у Neurospora crassa и npe-мейотически индуцируемое метилирование (MIP — Metylation Induced Pre-meiotically) у Ascobolus immer-sus, которые, по-видимому, осуществляются без участия РНК-посредника, поскольку они происходят независимо от транскрипционного состояния локуса (Galagan and Selker, 2004). Вместо этого в RIP и MIP участвуют спаренные локусы, где (например) две из трех копий гена сайленсированы, что заставляет предполагать какого-то рода механизм взаимодействия ДНК-ДНК, включающий гомологичные локусы для индукции сайленсинга. Напротив, для сайленсинга неспаренной ДНК в мейозе (MSUD — silencing of unpaired DNA in meiosis), который также происходит у Neurospora, требуется RNAi-путь (Shiu et al., 2001; обсуждается в главе 6); возможно, параллели MSUD имеются и у других организмов, в том числе С. elegans (Maine et al., 2005; глава 15).

3. RNAi и сборка гетерохроматина у S. pombe

Хромосомы S. pombe содержат в центромерах и «молчащих» локусах типа спаривания (mat2/3) обширные участки гетерохроматиновой ДНК. ассоциированные с лежащими в их основе повторяющимися элементами ДНК (Grewal, 2000; Pidoux and Allshire, 2004). Каждая центромера дробянковых дрожжей содержит уникальный центральный коровый район (cnt), который фланкируется повторами двух типов, называемыми самыми внутренними (imr — innermost) и самыми внешними (otr — outermost) повторами (рис. 8.2). Район otr сам состоит из повторов dh и dg.

Формирование гетерохроматина у S. pombe включает совместное действие ряда trans-действующих факторов Сюда входят деацетил азы гистонов (HDACs), Clr4, метилтрансфераза лизина 9 гистона H3 (HKMT) и белки, связывающиеся с H3K9-метилом гистона, Swi6 (гомолог НР1) и Chp1. Предполагается, что первоначальное рекрутирование Swi6 и Chp1 к хроматину приводит к распространению метилирования H3K9 и формированию гетерохроматина через последовательные циклы катализируемого Clr4 метилирования H3K9, сопряженного с опосредуемым Swi6 распространением на соседние нуклеосомы через его самоассоциацию (Grewal and Moazed, 2003).