Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 7.3. Структурное наследование полярности кортикальной ячейки у Paramecium

^{(а) Иммуномечение базальных телец и корешков реснички выявляет регулярную организацию параллельных кортикальных рядов у клеток дикого типа. Показаны вентральный (слева) и дорзальный (справа) виды, (б) Дорзальная сторона клетки, демонстрирующей нарушение этой регулярной организации благодаря обращенной переднее-задней полярности нескольких рядов кортикальных ячеек. Базальные тельца изображены красным цветом, цилиарные корешки — зеленым, (в) Увеличенный вид участка кортекса показывает обращенную ориентацию инвертированных рядов (I) по отношению к нормальным рядам (N). (г) Схематическое изо­ бражение дупликации базальных телец (зеленые кружки) в процессе роста; показано, что каждое тельце фланкировано с правой стороны переднее-ориентированным цилиарным корешком (пурпурный цвет) и двумя микротубулярными лентами. Дупликация происходит с фиксированной геометрией: каждое новое базальное тельце позиционируется спереди от своего родительского тельца, обеспечивая тем самым идентичную полярность, (д) Повторная дупликация базальных телец в пределах каждого ряда поддерживает однородную ориентацию бесконечно долго (фотографии любезно предоставлены Janine Beisson)}

Эти опыты с пересадками показали, что гены не отвечают за наследование таких структурных вариаций, и вскрыли существенную роль предсуществующих структур для правильной сборки новых структур. Ориентированная дупликация центриоли (Beisson and Wright, 2003) и воспроизведение формы жгутика при клеточном делении трипаносом (Moreira-Leite et al., 2001) представляют собой другие примеры этого явления. Прионы — еще один пример самовоспроизводящихся конформаций белков, которые ответственны за цитоплазматическую наследственность у дрожжей и млекопитающих (Shorter and Lindquist, 2005). Даже центромера эукариотических хромосом ведет себя как самореплицирующийся белковый комплекс, который находится на ДНК, но не детерминируется ею (Cleveland et al., 2003; см. Главу 14). Эти эпигенетические явления говорят нам, что не все клеточные структуры могут быть собраны de novo простым считыванием информации, содержащейся в генах. В более широком смысле репликация самой ДНК есть случай структурного наследования, но геном наверняка не является единственной структурой, которую делящиеся клетки вынуждены дуплицировать. Таким образом, «эпигенетическая» структурная наследственность, вместо того чтобы быть редким курьезом, может рассматриваться как один из наиболее фундаментальных механизмов жизни.

5. Макронуклеусы и микронуклеусы: модель активного и «молчащего» хроматина

Одна из основных концепций в эпигенетике заключается в том, что индивидуальные копии некоей нуклеотидной последовательности ДНК могут обладать различными активностями и что эти дифференцированные состояния могут стабильно поддерживаться (сохраняться). Ядерный диморфизм инфузорий — это естественный (природный) пример гомологичных последовательностей, которые находятся в общей цитоплазме и, тем не менее, обладают противоположными состояниями активности. Макронуклеус служит моделью транскрипционно активного состояния, а микронуклеус — репрессированного, или «молчащего» состояния (рис. 7.4). Ранние биохимические и иммуногистохимические исследования, главным образом на Tetrahymena, имели целью сравнить свойства этих различных ядер как в вегетативных клетках, так и в ходе полового развития, для того чтобы определить, каким образом эти разные состояния активности могут детерминироваться, в частности, на уровне структуры хроматина.

5.1. Разделение микро- и макронуклеарных гистонов выявляет различную роль вариантов гистонов

Выделение гистоновых белков отдельно из макронуклеуса и микронуклеуса Tetrahymena привело к открытию специфических вариантов гистонов. Варианты гистонов hvl и hv2, которые, как теперь известно, аналогичны вариантам H2A.Z иH3.З других эукариот, соответственно (глава 13), обнаруживаются исключительно в макронуклеусах, что явилось одним из самых ранних указаний на то, что эти варианты важны для поддержания транскрипционной акивности (Allis et al., 1980; Hayashi et al., 1984).

Было показано, что вариант hv2 (H3. 3) экспрессируется конститутивно — свойство, критичное для отложения этого варианта в хроматине вне фазы S, что позволяет этой изоформе гистона H3 служить в качестве гистона замещения (Yu and Gorovsky, 1997).

В дополнение к различным наборам вариантов коровых гистонов макронуклеус и микронуклеус содержат различные линкерные гистоны. Макронуклеарный Н1 имеет аминокислотный состав и биохимические свойства, сходные с таковыми линкерных гистонов других эукариот, но у него отсутствует центральный глобулярный домен (Wu et al. 1986; Hayashi et al., 1987). Ни один ген линкерного гистона не является существенным для жизнеспособности клетки. Интересно, что нокауты по любому из них вызывают увеличение объема соответствующих ядер, показывая, что оба они играют роль в общей компактизации хроматина, возможно путем стабилизации структуры хроматина более высокого порядка (Shen et al., 1995). Утрата макронуклеарного Н1-подобного белка также приводит к ген-специфичным изменениям в экспрессии, позволяя думать, что этот линкерный гистон поддерживает должную регулировку транскрипции (Shen and Gorovsky, 1996).

5.2. Модификации хроматина коррелируют с состояниями активности

Типерацетилирование гистонов в макронуклеусе и отсутствие этой модификации в микронуклеусе дали новые данные, позволяющие связать эту посттрансляционную модификацию с активацией генов (Vavra et al., 1982). Ферменты, осуществляющие ацетилирование гистонов у любого организма, оставались неизвестными до середины 1990-х годов, когда С. Дэвид Аллис и его сотрудники очистили первую гистоновую ацетилтрансферазу (HAT) типа А (ядерную) (Brownell and Allis, 1995; Brownell et al., 1996) Эти исследователи начали с высокоочищенных макронуклеусов для того, чтобы отделить эту активность от активности цитоплазматической HAT типа В, и продолжили очистку с помощью тестирования в геле (in-gel assay). Для этого метода очищенные гистоны были заполимеризованы в полиакриламидную матрицу геля, используемого для разделения фракций очищенных белков. После электрофореза эти белки были ренатурированы и проинкубированы с ацетил-СоА, несущим радиоактивную метку, для того чтобы выявить полипептид с кажущейся молекулярной массой 55 kD. который мог бы включить эту метку в гистоновый матрикс.

Puc. 7.4. Ядерный диморфизм у инфузорий

^{Микронуклеус (зародышевая линия), развивающийся макронуклеус и соматический макронуклеус содержат разные наборы гистонов и их модификаций. Перечислены те из них, о которых известно, что они специфически локализованы в ядрах каждого из этих типов или в развивающемся соматическом геноме}

Действительный прорыв произошел после микро-секвенирования этого очищенного белка и клонирования гена. Эта HAT, выделенная из Tetrahymena, оказалась гомологичной хорошо охарактеризованному регулятору транскрипции пекарских дрожжей — белку Gcn5. До этого открытия думали, что активаторы транскрипции в основном действуют, рекрутируя РНК-полимеразу к промоторам, но эта работа показала, что активаторы транскрипции могут также обладать ферментативной активностью, модифицируя хроматин или другие регуляторы транскрипции и меняя таким образом состояние матрицы. Дверь была открыта, и вскоре после этого было показано, что многие известные регуляторы действуют как HATs.

Ядерный диморфизм инфузорий еще раз доказал свои преимущества в выяснении роли метилирования гистонов. Эта модификация у растущих клеток Tetrahymena ограничена макронуклеусами (рис. 7.4). Активность метилтрансферазы лизина гистонов (HKMT), очищенная из этих ядер, специфически модифицировала гистон 3 по лизину 4 (H3K4те), установив тем самым одну из первых корреляций между этой специфической модификацией и транскрипционной активностью (Strahl et al., 1999).

Метилирование гистона H3 по лизину 9 у вегетативно размножающихся клеток отсутствует, но специфически происходит во время развития макронуклеусов на ограниченных зародышевой линией последовательностях, которые элиминируются из соматического генома (Tav-ema et al., 2002). Регулируемое развитием установление H3K9me2 (диметилирование) на этих специфических последовательностях дает нам полезную модель для выяснения нацеливания этой модификации на эквивалент гетерохроматина (в деталях описывается ниже)

Очистка меченных Р³² гистонов из микро- и макронуклеусов показала, что H3, Н2А и линкерные гистоны сильно фосфорилированы (Allis and Gorovsky, 1981). Фосфорилированы множественные сайты макронуклеарного Н1, и эта модификация, как было показано, участвует в регулировании транскрипции специфических генов (Mizzen et al., 1999). С помощью мутационного анализа Доу и Горовски [Dou and Gorovsky] обнаружили, что эту потребность в фосфорилировании можно было имитировать добавлением в Н1 заряженых аминокислот (Dou et al., 1999). Однако эти заряженные остатки не обязательно должны находиться в соответствующих позициях фосфорилированной аминокислоты; для комплементарного эффекта требуется наличие кластера заряженных сайтов (Dou and Gorovsky, 2000,2002). Эти исследования показали, что само по себе фосфорилирование не требовалось, но что соответствующая транскрипция стимулировалась критической плотностью зарядов.

В гистоне H3 фосфорилирована единственная позиция. серии 10 (H3S10ph) (Wei et al., 1998). Эта модификация зависит от клеточного цикла и коррелирует с митозом у многих эукариот. У Tetrahymena в ходе митоза и мейоза она ограничена микронуклеусами. Замещение нормального гена гистона H3 мутантной формой, содержащей замену серина 10 аланином (S10A), вызывает дефекты в делении микронуклеуса, результатом чего оказывается отставание хромосом и анэуплоидия (Wei et al., 1999). Однако амитотическое деление макронуклеуса не затрагивается. Эти результаты демонстрируют, что фосфорилирование H3 играет важную роль в конденсации и (или) сегрегации хромосом. Уникальный ядерный диморфизм инфузорий опять позволил получить ключевые данные о роли модификаций хроматина.

6. В ходе развития макронуклеуса происходят общегеномные перестройки

Секвенирование соматических (макронуклеарных) геномов P. tetraurelia и Т. thermophila обнаружило очень большое число генов (-40 000 и -27 000, соответственно) несмотря на относительно небольшие размеры геномов (-72 Мб и -104 Мб, соответственно). Эта организация согласуется с геномом, оптимизированным для эффективной экспрессии генов (сравнение с другими эукариотными организмами см. на рис. 3.15). Это «упрощение» («streamlining») соматического генома достигается за счет массивных перестроек ДНК хромосом, происходящих из зародышевой линии, которые имеют место на специфических стадиях макронуклеарного развития (обзоры см.: Prescott, 1994: Coyne et al., 1996; Klobutcher and Herrick, 1997; Jahn and Klobutcher, 2002). Таким образом, ядерная дифференцировка генома зародышевой линии и генома соматического включает физическую реорганизацию хромосом в дополнение к установлению только что описанных различных состояний хроматина.

Обычно наблюдаются два типа перестроек, которые поистине уникальны для всех инфузорий, которые только были исследованы: внутренние делеции ДНК и фрагментация хромосом (рис. 7.5). Примеры этого у других эукариот могут быть представлены локализованной рекомбинацией локуса VDJ в лимфоцитах млекопитающих (глава 21). В зависимости от вида инфузории из каждого вновь формирующегося генома в результате этих событий элиминируются от 10 до 95 % генома зародышевой линии Элиминируются фактически все повторяющиеся последовательности, включая перемещаемые элементы, что частично объясняет наблюдаемую высокую плотность генов в макронуклеусах. Число сайтов перестроек также варьирует у разных видов, от примерно 6 000 у Tetrahymena до, вероятно, 100 000 у брюхоресничных инфузорий. Распределение по всему геному этих высоко регулируемых и воспроизводимых событий дает возможность исследовать, каким образом клетки идентифицируют конкретные сегменты ДНК и направляют свое действие на них. Изучение перестроек ДНК у инфузорий уже позволило вскрыть уникальные особенности эпигенетических механизмов, в частности относящихся к зависящим от гомологии процессам. Нижеследующее описание событий, связанных с перестройками ДНК, должно дать достаточную основу для последующего обсуждения связанной с этим эпигенетической регуляции.

Рис. 7.5. Перестройки ДНК у инфузорий

^{В ходе развития нового макронуклеуса происходят широкомасштабные фрагментация хромосом и элиминация ДНК. (Вверху) Перестройки ДНК, происходящие у Paramecium, включают как точные делеции IESs, ограниченных нуклеотидами ТА (цветные прямоугольники, находящиеся в кодирующих (стрелка) и некодирующих районах), так и неточные делециии (оранжевые прямоугольники), дающие в результате либо делецию ДНК. либо фрагментацию (G4T3). (Внизу) У Tetrahymena неточная деления IESs (цветные прямоугольники) происходит примерно в 6000 локусов, а фрагментация хромосом детерминируется консервативной последовательностью длиной 15 пн — CBS (звездочка)}

6.1. Внутренняя делеция ДНК: события, связанные с точными (внутригенные IESs) и неточными (межгенные повторы) делециями

Точные делеции

Точные делеции — это такие делеции, которые происходят в одних и тех же позициях нуклеотидной последовательности во всех копиях макронуклеарных хромосом. Внутренние элиминируемые последовательности (IESs) — это короткие, однокопийные сегменты ДНК, которые удаляются главным образом из кодирующих последовательностей, но обнаруживаются и в межгенных или интронных районах хромосом зародышевой линии (рис. 7.5). Точно вырезаемые IESs ограничены короткими прямыми повторами, которые, как правило, различаются по последовательности у разных видов. Заметный класс так называемых “ТА”-IESs, обнаруживаемых у Paramecium и некоторых спиротрих, таких как Euplotes crassus, идентифицируется как обладающий инвариабельными повторами 5’-ТА-3’ на их границах, одна копия которых остается в макронуклеарном локусе после эксцизии (Betermier, 2004). Немногочисленные нуклеотидные позиции, внутренние по отношению к динуклеотидам ТА, не являются случайными и образуют вырожденный консенсус, напоминающий концы транспозонов Тс1/ mariner. Таким образом, эти IESs эволюционно могут быть производными древних инсерций таких мобильных элементов (Klobutcher and Herrick, 1997). Тем не менее, концы многих IESs плохо соответствуют этой консенсусной последовательности, тогда как многие хорошие соответствия можно обнаружить в макронуклеарных последовательностях, которые не вырезаются, что указывает на то, что этот консенсус не содержит достаточной информации для того чтобы специфицировать вырезание приблизительно 60 000 IESs на гаплоидный геном P. tetraurelia. Возникает вопрос, каким же образом они распознаются.

Удивительное варьирование точного вырезания наблюдается у стихотрих (подгруппа спиротрих), у которых удаление IES происходит одновременно с «упорядочиванием» («unscrambling») генов (Prescott, 1999). В микронуклеарной версии «перетасованных» генов последовательности, предназначенные для оставления в макронуклеусе (MDSs, т.е. ДНК-«экзоны») не только разделяются IESs, но и «перетасованы» относительно линейного порядка, обнаруживаемого в реорганизованной макронуклеарной последовательности. В зародышевой линии две MDS, которые окажутся соединенными, чтобы образовать экспрессируемый ген, могут быть локализованы далеко друг от друга, иногда даже в несцепленных локусах (Landweber et al., 2000), и могут даже находиться в инвертированной ориентации относительно друг друга. Точность упорядочивания, по-видимому, направляется относительно длинными (в среднем 11 пн) гомологичными повторами, общими для родственных MDS-концов, которые не родственны по последовательности повторам на концах других MDS Хотя эти длинные повторы наверняка вносят вклад в точное упорядочивание, остается неясным, достаточно ли их; это привело к предположению, что здесь возможно участие предсуществующей матрицы (Prescott et al., 2003).