Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Неточные делеции

Хотя IESs эффективно и воспроизводимо удаляются из соматического генома, в некоторых случаях границы делеции, формируемые независимыми событиями вырезания в полиплоидном ядре, варьируют по своему положению (рис. 7.5). Эта гетерогенность распространяется на десятки пар оснований у Tetrahymena и до нескольких килобаз у Paramecium. Неточная делеция характерна для всех исследованных IESs у Tetrahymena и в первую очередь ответственна за удаление повторяющихся последовательностей, таких как межгенные транспозоны или минисателлиты у Paramecium (Le Motuil et al., 2003). Подобно точной эксцизии IESs эти делеции в норме происходят между короткими прямыми повторами, один из которых сохраняется в макронуклеарной последовательности. У Tetrahymena повторяющиеся последовательности очень вариабельны среди известных IESs, тогда как у Paramecium эти повторы всегда содержат по крайней мере один динуклеотид ТА; это позволяет предположить, что соответствующий механизм может быть связан с механизмом точного вырезания IES.

6.2. Фрагментация хромосом

Во время развития макронуклеуса хромосомы, происходящие из зародышевой линии, фрагментируются на более короткие молекулы, которые кепируются добавлением de novo теломерных повторов (рис. 7.5). Получающиеся в результате этого макронуклеарные хромосомы, по всей видимости, не имеют центромер, и таким образом хромосомная фрагментация может облегчать равное распределение этих молекул при амитотических делениях макронуклеуса. Степень фрагментации широко варьирует у разных видов. У спиротрих фрагментация достигает крайней степени, давая крошечные «нанохромосомы», обычно содержащие по одному гену, тогда как у Paramecium и Tetrahymena макронуклеарные хромосомы варьируют по размеру от 20 Кб до более чем 1 Мб и содержат по много генов.

У большинства инфузорий этот процесс является неточным, так что точное положение добавления теломерных повторов оказывается гетерогенным и часто приводит к некоторым потерям последовательностей зародышевой линии. Одно из исключений — Euplotes crassus, у которого теломеры всегда добавляются в одних и тех же нуклеотидных позициях (Klobutcher, 1999). У Tetrahymena консервативная последовательность хромосомного разрыва длиной 15 пн (CBS), обнаруженная в 280 локусах хромосом зародышевой линии (Cassidy-Hanley et al., 2005; Hamilton et al., 2005), является и необходимой, и достаточной для направления фрагментации и добавления новых теломер (Fan and Yao, 1996). Напротив, у видов P. aurelia никаких аналогичных CBS не было идентифицировано. Скорее, все данные показывают, что фрагментация хромосом является альтернативным результатом неточных делеций (рис. 7.5); при таких делециях элиминация ДНК залечивается либо путем воссоединения фланкирующих последовательностей, либо путем добавления теломер (Le Моил1 et al., 2003).

7. Механизмы перестроек генома

Хотя геномные перестройки инфузорий исследуются более 30 лет, молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий, остаются в основном неизвестными (Yao et al., 2002). Частично задачей, стояшей перед исследователями, было объяснить разнообразие событий, которые наблюдаются у разных инфузорий. Для нескольких инфузорий были описаны эксцизионные интермедиаты, а также (побочные) продукты циркулярной эксцизии (Jaraczewski and Jahn, 1993; Klobutcher et al., 1993; Williams et al., 1993; Saveliev and Cox, 1995, 1996; Betermier et al., 2000; Gratias and Betermier, 2003). Эти данные не позволяют вывести единый механизм эксцизии даже для тех IESs разных инфузорий, которые имеют на своих концах сходные консенсусные последовательности (см. Klobutcher and Herrick, 1995; Gratias and Betermier, 2001; Betermier, 2004).

Несмотря на разнообразие механизмов эксцизии может все же иметь место значительное перекрывание в событиях, направляющих перестройки ДНК. Одной из общих черт является то, что транспозоноподобные и повторяющиеся последовательности элиминируются, по-видимому, преимущественно. Как описывается в этой книге, одна из ролей эпигенетических механизмов заключается в том, чтобы подавлять активность этих потенциально вредоносных ДНК-элементов. Разрешение для транспозона переместиться из «молчащей» зародышевой линии в высоко активный макронуклеус является потенциально гибельным для соматического генома. Многие и разнообразные данные указывают на механизмы, связанные с RNAi и формированием гетерохроматина, как на участников этих процессов перестроек ДНК (Mochizuki and Gorovsky, 2004; Yao and Chao, 2005).

У большинства эукариот гистон H3, метилированный по лизину 9 (H3K9me), в значительной степени ассоциирован с репрессированной ДНК, вычленяемой в ядре как гетерохроматин (см. раздел 7 главы 3). У Tetrahymena эта модификация не обнаруживается в транскрипционно «молчащем» микронуклеусе, как можно было бы предположить, но обнаруживается исключительно в развивающихся макронуклеусах непосредственно перед перестройками ДНК или одновременно с ними (Taverna et al., 2002). Эксперименты по иммунопреципитации хроматина показали, что этой модификацией обогащены гистоны, связанные с IESs. Элиминация ДНК и формирование гетерохроматина были первоначально сцеплены друг с другом в результате идентификации хромодоменсодержащего белка (Pddl — Programmed DNA Degradation 1 protein) — обильно представленного, экспрессируемого в ходе развития белка, колокализующегося в фокусах, содержащих ДНК, ограниченную зародышевой линией и подлежащую элиминации (т.е. IESs) из соматического генома (Madireddi et al., 1994, 1996). Хромодомены — это белковые мотивы, обладающие сродством, способностью связываться с некоторыми остатками метилированных гистонов. Возможно, что архетипическая модель участия хромодоменного белка в регуляции хроматина — это связывание гетерохроматинового белка 1 (НР1 — содержащий хромодомен) с метилированным H3K9 у Drosophila, играющее роль в формировании гетерохроматиновых доменов (детали см в главе 5). Хромодомены Pddl и Pdd3, два белка, требующихся для перестроек ДНК (Coyne et al., 1999; Nikiforov et al., 2002), связываются с пептидами

H3K9me2 (Taverna et al., 2002). Для того чтобы продемонстрировать, что эта модификация хроматина требуется для перестройки ДНК, Лиу, Мочицуки и Горовски [Liu, Mochizuki and Gorovsky] использовали методику гомологичного замещения гена, чтобы заменить гены основного гистона H3 копиями, содержащими мутацию, поменявшую лизин 9 (K9Q) (Liu et al., 2004). Эти клетки не могли эффективно удалять IESs в ходе развития несмотря на тот факт, что Pddl локализовалась соответственно в предшественниках макронуклеусов, показывая тем самым, что H3K9me2 требуется для элиминации ДНК. Из-за того, что установление состояний хроматина является ключевым детерминантом эпигенетической регуляции, важный вопрос заключается в следующем: каким образом метка H3K9me2 специфически нацеливается на сегменты ДНК, обреченные на элиминацию? Как описывается ниже, несколько экспериментов продемонстрировали, что в направлении перестроек ДНК участвуют гомологичные РНК.

8. Зависящий от гомологии сайленсинг генов у инфузорий

Зависящие от гомологии, опосредуемые РНК механизмы сайленсинга широко используются эукариотами для эпигенетической регуляции. Данные о том, что такие механизмы активны у инфузорий, впервые были получены на Paramecium после трансформации вегетативного макронуклеуса неэкспрессибельными трансгенами, которые производят фенокопию менделевских мутантов в эндогенных генах. Сходные эффекты были затем воспроизведены у Paramecium и спиротрих при скармливании клеткам двунитевых РНК, что позволяло предполагать участие механизмов RNAi. Один из этих механизмов ведет к крайней форме сайленсинга генов — элиминации ДНК.

8.1. Сайленсинг, индуцируемый трансгенами

Макронуклеус Paramecium легко трансформировать с помощью микроинъекций, потому что любой введенный в него фрагмент ДНК может поддерживаться в широком диапазоне числа копий, реплицируясь автономно без потребности в каком-либо специфическом ориджине. Трансформация высококопийными, неэкспрессибельными трансгенами может переключить посттранскрипционный сайленсинг эндогенных генов, обладающих достаточным сходством по последовательности (Ruiz et al., 1998; Galvani and Sperling, 2001). Сайленсинг не наблюдается, если в трансгене присутствует 3’UTR гена (Galvani and Sperling, 2001), что заставляет предполагать, что регуляторные сигналы, присутствующие в РНК, влияют на способность конструкта индуцировать сайленсинг. Впоследствии оказалось, что сайленсинг коррелирует с накоплением гомологичных коротких РНК длиной приблизительно 23 нуклеотида (н) (Gamier et al., 2004); это указывает на связь с путем RNAi. Эти короткие РНК длиной -23 н, по-видимому, ответственны за прицельную деградацию гомологичных mRNAs и могут быть поэтому названы siRNAs (short interfering RNAs — короткие интерферирующие РНК). Сходный класс РНК длиной 23—24 н был также идентифицирован в вегетативных клетках Tetrahymena, и хотя какие-либо данные об их возможной роли отсутствуют, вполне вероятно, что они представляют собой эндогенные siRNAs (Lee and Collins, 2006).

8.2. Сайленсинг индуцируется двунитевой РНК

Двунитевая РНК (dsRNA) является вероятным первичным триггером для индуцируемого трансгеном сайленсинга, наблюдаемого у Paramecium. Сайленсирующая эффективность трансгенов коррелирует с образованием аберрантных молекул РНК, соответствующих как смысловой, так и антисмысловой нитям инъецированной последовательности. Более того, способность dsRNA стимулировать сайленсинг гена была продемонстрирована путем скармливания клеткам Paramecium бактерий Escherichia coli, экспрессирующих dsRNA клонированного гена, с использованием методологии, разработанной для Caenorhabditis elegans (Timmons and Fire, 1998; Timmons et al., 2001). Сайленсинг эндогенного гена можно наблюдать фенотипически спустя всего три вегетативных деления, т.е. меньше чем через 24 часа (Galvani and Sperling, 2002). Скармливание убитых нагреванием E.coli цнфузориям-спиротрихам, в норме питающимся водорослями, также индуцирует генный сайленсинг (Pashka et al., 2003), заставляя предполагать, что многие разные инфузории обладают этим механизмом. У Paramecium молекулярный анализ показал, что кормление dsRNA приводит к накоплению таких же -23-нуклеотидных siRNAs, какие наблюдаются после сайленсинга, индуцируемого трансгеном (Nowacki et al., 2005); это указывает, что оба эти явления базируются на общем RNAi-пути.

Сайленсинг, индуцируемый у Paramecium скармливанием dsRNA, может быть немедленно ревертирован замещением E.coli в культуральной среде нормальными пищевыми бактериями; аналогичным образом прямая микроинъекция dsRNA в цитоплазму индуцирует лишь временный, преходящий сайленсинг гомологичных генов, предположительно потому, что инъецированная dsRNA быстро разбавляется в ходе вегетативного роста (Galvani and Sperling, 2002). Эти наблюдения позволяют предположить, что молекулы dsRNA не могут быть амплифицированы до сколько-нибудь значительного уровня в цитоплазме вегетативных клеток, в отличие от судьбы dsRNA в С.elegans, где это может приводить к наследуемому сайленсированному состоянию. Это, далее, предполагает, что RNAi у Paramecium не приводит к установлению стабильного транскрипционного сайленсинга гена в макронуклеусе. Наследуемый сайленсинг, вероятно, требовал бы метилирования гистона H3K9. А, как упоминалось выше, эта модификация, очевидно, отсутствует в вегетативном макронуклеусе, по крайней мере у Т. thermophila.

9. Перестройки генома направляются зависящими от гомологии механизмами

Во время развития инфузории три разных генома должны различаться и канализироваться по трем раздельным направлениям: микронуклеарный геном зародышевой линии должен сохраняться интактным, в то время как развивающийся соматический геном в новом макронуклеусе направляется таким образом, чтобы подвергнуться экстенсивной реорганизации; материнский же соматический геном обречен на разрушение. В этих более широких рамках цель исследователей, работающих на инфузориях, заключалась в том, чтобы понять воспроизводимость паттернов ДНК-перестроек. Первоначальные усилия были направлены на то, чтобы идентифицировать ds-активные мотивы ДНК-последовательностей, которые могли бы рекрутировать рекомбинационные белки, но поиски дали мало четких результатов (см.: Yao et al., 2002; Betermier, 2004). Первичная ДНК-последовательность определенно не является единственным детерминантом, направляющим реорганизацию макронуклеарного генома, — вывод, подкрепляемый данными о том, что H3K9-метилирование маркирует сегменты ДНК для элиминации. Более того, многие паттерны перестроек, как описано ниже, чувствительны к зависящим от гомологии эффектам, что делает возможным наследование альтернативных паттернов по материнской линии в последующих половых поколениях, независимо от Менделевской передачи генома дикого типа зародышевой линии Наследование паттернов перестройки удовлетворяет, следовательно, определению эпигенетического явления.

9.1. Экспериментальная индукция специфических делеций в развивающемся макронуклеусе

Еще до того как посттранскрипционный сайленсинг генов был описан у Paramecium, было обнаружено, что введение клонированных последовательностей в большом числе копий в вегетативный макронуклеус изменяет ДНК-перестройки в половом потомстве трансформированных клонов. Удивительно, что последовательности, гомологичные трансгену, специфическим образом делегировались по неточному механизму, в то время как микронулеарный геном оставался интактным (рис. 7.6) (Meyer, 1992). Это явление, по-видимому, было весьма общим, поскольку все испытанные фрагменты ДНК могли производить делеции (Meyer et al., 1997). Эти эксперименты показывали, что в ходе половых событий сиквенс-специфичная информация передается через цитоплазму из трансформированного материнского макронуклеуса в развивающийся зиготический макронуклеус. Эта всеобщность данного эффекта говорила не в пользу тех трактовок, в которых роль отводилась сиквенс-специфичным ДНК-связывающим белкам, продуцируемым или титруемым инъецированными трансгенами. Наиболее экономное объяснение, согласующееся с наблюдаемой специфичностью, предполагает, что нуклеиновые кислоты, предположительно молекулы РНК, переносятся между ядрами и распознают свои мишени на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании.

Рис. 7.6. Индуцированные трансгеном делеции у Paramecium

^{(а) У дикого типа ген А (красные стрелки) расположен вблизи гетерогенных концов макронуклеарной хромосомы; розовые прямоугольники = макронуклеарные теломеры. Паттерн перестроек макронуклеарной хромосомы надежно репродуцируется в ряду поколений, (б) Введение большого числа копий трансгенов А в материнский макронуклеус может индуцировать полную делецию эндогенного гена А в половом потомстве, когда новый макронуклеус развивается из производного зародышевой линии дикого типа. Новые макронуклеарные теломеры располагаются непосредственно «вверх по течению» от гена А}

Конструкты, которые эффективно индуцируют постзиготические делеции, являются неэкспрессибельными трансгенами, такими как трансгены, содержащие мутации типа сдвига рамки считывания или усечения 5’ или 3’ UTRs (Gamier et al., 2004). Те из них, которые могут продуцировать стабильные, способные транслироваться иРНК, не стимулируют элиминацию гомологичных генов из развивающихся макронуклеусов. Те же конструкты, которые стимулируют делецию ДНК, вызывают также сайленсинг эндогенных материнских генов в ходе вегетативного роста трансформированных клонов. Таким образом, постзиготические делеции коррелируют с презиготическим сайленсингом и с накоплением ~ 2 3 - нукл еотид н ых siRNAs. Эти siRNAs, как было показано далее, сохраняются в клетках на протяжении всего развития, что заставляет предполагать, что они могут отвечать за включение этих делеций.

Если ассоциированные с сайленсингом siRNAs направляют ДНК-перестройки, тогда введение dsRNA до начала или во время развития должно стимулировать элиминацию гомологичной последовательности в потомстве. Чтобы это проверить, клеткам Paramecium, которым скармливались E.coli штамма, продуцирующего dsRNA, гомологичную кодирующей последовательности ND7 — гену, участвующему в регулируемом экзоцитозе секреторных пузырьков, называемых трихоцистами, — дали возможность пройти автогамию и развить новые макронуклеусы из микронуклеусов дикого типа. Некоторое число поставтогамных потомков продемонстрировали мутантный фенотип ND7благодаря элиминации этого гена из их макронуклеусов (Gamier et al., 2004). Даже потомство фенотипически дикого типа показало частичную элиминацию копий гена ND7. Как и~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с трансген-индуцированным сайленсингом, ~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с кормлением dsRNA, сохранялись, как было показано, в этих клетках на протяжении всей аутогамии (Nowacki et al., 2005), подтверждая их участие в «нацеливании» постзиготических делеций. Явление индуцированной ДНК делеции, направляемой dsRNA, не ограничивается Paramecium. Микроинъекция конъюгирующим Tetrahymena смысловой и антисмысловой РНК, транскрибированной in vitro и гомологичной геномным локусам, в норме сохраняющимся в макронуклеусе, приводит к неточной делеции этих последовательностей (Yao et al., 2003).

10. Паттерны перестроек определяются, вероятно, путем сравнения геномов зародышевой линии и соматического

10.1. Парадигма d48: эпигенетическое наследование альтернативных перестроек

Хотя перестройки, индуцируемые трансгенами и dsRNA, иллюстрируют эпигенетическую природу процесса элиминации ДНК, возможно еще более удивительными являются наблюдения, что паттерны индуцированных перестроек могут наследоваться в последовательных раундах макронуклеарного развития. Первое доказательство эпигенетической регуляции перестроек было обнаружено, когда аберрантная делеция из макронуклеуса гена, кодирующего у P.tetraurelia поверхностный антиген А, оказалась цитоплазматически наследующейся в скрещиваниях с диким типом (рис. 7.7) (Epstein and Fomey, 1984). В макронуклеусах дикого типа ген А локализован вблизи конца хромосомы на расстоянии 8,13 либо 26 тн от теломеры, что диктуется тремя альтернативными сайтами фрагментации. Было обнаружено, что вариантная клеточная линия, называемая d48, не экспрессирует ген А, потому что сам этот ген был утерян вместе со всеми последовательностями «вниз по течению», когда формировалась его теломера на 5’-конце этого гена (Fomey and Blackburn, 1988). Эксперименты по трансплантации ядер подтвердили, что микронуклеус зародышевой линии d48 несёт ген А дикого типа. Например, замена микронуклеуса d48 микронуклеусом штамма дикого типа не предотвращает материнской передачи делеции гена А половому потомству; и наоборот, микронуклеус d48, будучи трансплантирован в клетку дикого типа, давал начало после автогамии новому макронуклеусу, который содержал ген A (Harumoto, 1986; Kobayashi and Koizumi, 1990). Сходные эксперименты, сфокусированные на поддержании или делеции еще одного проксимального по отношению к теломере гена поверхностного антигена, гена В, показали, что такие материнские эффекты могут наблюдаться и в других районах генома (Scott et al., 1994). В совокупности эти исследования заставляют предполагать, что некий геномный район должен присутствовать в материнском макронуклеусе для того, чтобы эффективно сохраняться и амплифицироваться в развивающемся макронуклеусе до числа копий, характерного для дикого типа.