Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Наверняка любой наблюдавший инфузорий под микроскопом был поражен этими сложными маленькими животными, использующих свои волосковидные реснички для плавания, питания и поисков партнера. Вегетативно растущие клетки удваиваются путем простого бинарного деления; тем не менее, периодически инфузории спариваются с партнерами или, у некоторых видов, претерпевают самооплодотворение, в результате чего получается половое потомство с иным генотипом. Уникальной отличительной чертой этих одноклеточных эукариот является то, что они поддерживают в общей цитоплазме два функционально различающихся генома, содержащихся в отдельных ядрах. Меньшее из них, микронуклеус, содержит геном зародышевой линии. Он транскрипционно «молчит» в ходе роста, но сохраняет генетическую информацию, которая передается потомству в каждом половом поколении. Более крупное ядро, макронуклеус, осуществляет соматические функции, поскольку отвечает за всю экспрессию генов и таким образом управляет фенотипом клетки. Он элиминируется в конце каждого вегетативного цикла, когда из зародышевой линии дифференцируется новый макронуклеус. Во время развития макронуклеуса в результате массивных перестроек ДНК создается отредактированная версия генома, готовая для экспрессии. Часть генома зародышевой линии, включая всю повторяющуюся ДНК, долгое время считавшуюся «мусорной», элиминируется, тогда как все гены, необходимые для выживания организма в жизненном цикле, амплифицируются до высокого уровня плоидности.

Генетические странности инфузорий сделали их очень полезными модельными организмами для обнаружения и понимания эпигенетических механизмов. У некоторых видов два потомка-сибса, развивающиеся после спаривания, начинают свою жизнь с идентичными геномами, но их соматические ядра дифференцируются в контексте двух разных родительских клеток. Это позволяет легко выявлять наследственные признаки, которые не детерминируются исключительно ядерным геномом. Генетические эксперименты, проведенные с Paramecium tetraurelia, прежде всего эксперименты, проведенные Треси Соннеборном, дали одно из самых ранних описаний неменделевского наследования у эукариот вообще. Среди случаев, в которых генетически идентичные сибсы экспрессировали разные варианты специфических признаков, некоторые были истинными примерами цитоплазматической наследственности (материнского наследования ДНК органелл), но другие. такие как наследование типов спаривания особи, были случаями иного рода. Тип спаривания потомка не определялся его генотипом; скорее, он специфицировался предсуществующим типом родительской клетки, в которой развивался его соматический геном. Выражаясь простыми терминами, можно сказать, что разные внешние условия (родительская цитоплазма) направляют экспрессию альтернативных признаков, исходя из идентичных наборов ДНК. А это является отличительной чертой эпигенетики.

Особая генетическая организация инфузорий предполагает также наличие механизмов, дифференциально регулирующих гомологичные последовательности, содержащиеся в разных ядрах. Ранние исследования имели целью выяснить способы, которыми зародышевая линия поддерживалась «молчащей», а соматический геном — транскрипционно активным. Компартментализация состояний генной экспрессии дала исследователям возможность изучать роль белков хроматина и их модификаций в эпигенетической регуляции. Они могли легко соотносить специфические гистоны и их модификации с транскрипционной активностью или стадией клеточного цикла. Например, в результате сравнения белков хроматина из ядер зародышевой линии и соматических ядер Tetrahymena thermophila были идентифицированы некоторые из первых вариантов гистонов. Далее у этой инфузории были идентифицированы такие новые регуляторы хроматина, как первая апетилтрансфераза гистонов (HAT) — отчасти за счет использования того факта, что только макронуклеус содержит ацетилированные гистоны.

Хотя генетика инфузорий может показаться нестандартной, лежащие в ее основе механизмы широко используются для эпигенетической регуляции у эукариот, что иллюстрирует роль РНК-интерференции в перестройках целого генома. Степень и формы этих перестроек удивительно разнообразны у разных видов инфузорий, однако одна общая черта заключается в том, что они в норме направляют элиминацию транспозоноподобных элементов и других повторяющихся последовательностей. И у Paramecium, и у Tetrahymena с генома зародышевой линии во время мейоза генерируются короткие РНК. Обнаружение этих малых РНК, тот факт, что для перестроек ДНК у Tetrahymena требуются гомологи Argonaute и Dicer, позволили осознать, что здесь действует механизм, подобный РНК-интерференции. Полагают, что малые РНК нацеливают метилирование гистона H3 по лизину 9 на гомологичные последовательности, маркируя их для элиминации. Таким образом, с механистической точки зрения перестройки ДНК у инфузорий сходны с более широко используемым РНК-направляемым формированием хроматина. Использование RNAi для элиминации перемещаемых элементов еще более подчеркивает важность этого пути как механизма защиты генома. Далее, многие эксперименты показали, что паттерны перестроек ДНК не строго детерминированы геномом зародышевой линии, но контролируются — по крайней мере отчасти — предсуществующими перестройками в родительском соматическом геноме. Отсюда следует, что геномы зародышевой линии и соматический сравниваются друг с другом в ходе ядерной дифференпировки; это сравнение опосредуется, вероятно, зависящими от гомологии взаимодействиями между РНК зародышевой линии и соматическими. Полное понимание этого процесса несомненно позволит глубже проникнуть в роль РНК в эпигенетическом программировании генома.

1. Инфузории: одноклеточные с двумя разными геномами

Инфузории, образующие монофилетическую группу, возникшую около одного миллиарда лет тому назад (Philippe et al. 2000), были среди первых одноклеточных эукариот, использованных в качестве генетических моделей. В конце 1930-х годов, когда Т.М.Соннеборн открыл типы спаривания у Paramecium aurelia (Sonnebom 1937), хромосомная теория наследственности, разработанная Т.Х.Морганом, всё еще не удовлетворяла многих исследователей, в особенности эмбриологов (исторические детали см. в главе 2). Будучи не способны представить себе, как такие статичные сущности, как гены, могут быть единственной основой наследственности, они полагали, что цитоплазма должна участвовать хотя бы только в координации действия генов (см. Harwood 1985). В то время как генетики в основном были сосредоточены на действии генов, ранний генетический анализ, выполненный Соннеборном, показал, что передачу многих наследуемых признаков нельзя было полностью объяснить менделевскими законами. Изучение инфузорий, благодаря их уникальной биологии, позволило обнаружить некоторые первые примеры цитоплазматической наследственности и продолжает обеспечивать новые возможности проникновения в эпигенетические механизмы.

Одной из наиболее заметных черт инфузорий является ядерный диморфизм. Каждая клетка содержит ядра двух типов, различающихся по структуре и функции. Диплоидные микронуклеусы являются транскрипционно «молчащими» во время вегетативного роста, но содержат геном зародышевой линии. Эти ядра претерпевают мейоз и дают гаметические ядра, которые передают менделевский геном следующему половому поколению (рис. 7.1). В противоположность этому, высокополиплоидные макронуклеусы ответственны за экспрессию генов во время вегетативного роста и таким образом управляют фенотипом клетки, но они утрачиваются во время полового развития и могут, следовательно, рассматриваться как эквивалент сомы (рис. 7.1). Число ядер каждого типа варьирует у разных видов. Например, виды P. aurelia имеют два микронуклеуса и один макронуклеус, тогда как у Tetrahymena thermophila лишь по одному ядру каждого типа.

Макро- и микронуклеусы делятся с помощью разных механизмов. Микронуклеусы делятся путем обычного закрытого митоза. Макронуклеусы, напротив, делятся с помощью все еще недостаточно изученного механизма. который не связан с образованием веретена или с видимой конденсацией не имеющих центромер соматических хромосом. После синтеза ДНК макронуклеус просто расщепляется на две приблизительно равные части. Какой-нибудь механизм, обеспечивающий равное распределение макронуклеарных хромосом в два дочерних ядра, по-видимому, отсутствует. Вместо этого, вероятно, высокий уровень плоидности (~800n у P. tetraurelia, ~45n у Т. thermophila) предотвращает летальную утрату генов на протяжении ряда вегетативных делений. Большинство видов обладают конечной продолжительностью вегетативной жизни, и клональные клеточные линии в конечном счете погибают, если не принимают участие в половом воспроизведении, прежде чем станут старыми.

2. Конъюгация: реципрокное оплодотворение обнаруживает неменделевскую наследственность

Инфузории являются гермафродитными линиями, способными к конъюгации — процессу спаривания, включающему перекрестное оплодотворение между двумя родительскими клетками. Зрелые клетки соответствующего клонального возраста, обычно после легкого голодания, становятся сексуально реактивными и спариваются с клетками совместимых типов спаривания, чтобы начать конъюгацию. Если совместимый партнер отсутствует, некоторые виды обычно претерпевают процесс самооплодотворения, называемый автогамией. В обоих случаях за этим следует ядерная реорганизация, начинающаяся с мейоза микронуклеусов. Последовательность ядерных событий сходна у всех видов (хотя и имеются некоторые вариации) и изображена на рис. 7.1 для видов Р aurelia и Т. thermophila. (см. Sonnebom 1975).

Постмейотическое развитие начинается с выбора единственного гаплоидного ядра в каждой клетке для передачи генома. Выбранное ядро претерпевает дополнительное деление, даюшее два генетически идентичных гаметических ядра. В случае конъюгации два партнера обмениваются одним из двух своих гаплоидных ядер, и поэтому последующая кариогамия (т.е. слияние двух гаплоидных ядер) формирует в каждом конъюганте генетически идентичные зиготические ядра (стадии 3—5 на рис. 7.1). При автогамии два гаметических ядра в одной клетке сливаются и образуют полностью гомозиготный диплоидный геном. В обоих случаях получающееся в результате диплоидное зиготическое ядро (стадия 5) делится еще два раза, и четыре продукта этих делений дифференцируются: два — в новые микронуклеусы, а два — в новые макронуклеусы (стадии 6 и 7). По завершении развития ядерного аппарата в новых вегетативных клонах сохраняются либо оба новых микронуклеуса, как это имеет место у видов P. aurelia, либо одно из двух ядер деградирует, как у Т. thermophila. У обоих видов два новых макронуклеуса при первом клеточном делении не делятся (стадия 9), а распределяются в две дочерние клетки; они начинают делиться только при втором вегетативном делении.

В то время как родительские микронуклеусы дают начало новым микро- и макронуклеусам следующего поколения, родительский макронуклеус утрачивается. У P. aurelia он фрагментируется примерно на 30 кусков, в которых репликация ДНК быстро подавляется, хотя транскрипция активно продолжается на протяжении периода дифференцировки новых макронуклеусов. Когда вегетативный рост возобновляется, эти фрагменты распределяются случайным образом в дочерние клетки, пока не остается ни одного (стадия 9). У Т. thermophila родительский макронуклеус не фрагментируется, но пикнотизируется и деградирует по апоптозоподобному механизму до первого вегетативного деления (Davis et al. 1992) (стадии 7 и 8).

Рис. 7.1. Жизненные циклы Paramecium (вверху) и Tetrahymena (внизу)

^{(Стадия 1) Вегетативные клетки размножаются бинарным делением. Половое развитие (стадии 2—8) обычно начинается после конъюгации двух клеток или автогамии (только у Paramecium).}

^{(Стадии 2—3) Мейоз микронуклеуса заканчивается выбором одного из гаплоидных продуктов на роль гаметического ядра и дегенерацией остальных ядер. У Parmecium родительский макронуклеус начинает формировать лопасти.}

^{(Стадии 4—6) Формирование зиготы. Дополнительное деление выбранного ядра дает два генетически идентичных гаплоидных ядра. В ходе конъюгации одно из этих двух идентичных гаметических ядер обменивается на такое же ядро между двумя партнерами, и последующая кариогамия дает диплоидное зиготическое ядро (красный цвет). В ходе автогамии два идентичных гаметических ядра просто сливаются вместе. Два дополнительных постзиготических деления (6) дают недифференцированные микро- и макронуклеусы.}

^{(Стадии 6—8) Ядерная дифференцировка. После второго постзиготического деления из получившихся в результате ядер два становятся новыми микронуклеусами, тогда как два других начинают дифференцироваться в новые макронуклеусы (розовый цвет). У Paramecium материнский макронуклеус фрагментируется. У Tetrahymena он пикнотизируется. У Tetrahymena же один из новых микронуклеусов дегенерирует.}

^{(Стадия 9) Карионидное деление: Это первое вегетативное деление является особым, поскольку новые макронуклеусы распределяются в дочерние клетки без деления, тогда как микронуклеусы расходятся в клетки-потомки путем митоза. Наконец, фрагменты родительского макронуклеуса у Paramecium не делятся, но сохраняются до тех пор, пока не утрачиваются в результате случайного распределения при последующих делениях}

3. Цитоплазматическая наследственность у инфузорий

Биология конъюгации P. aurelia чрезвычайно благоприятна для выявления эпигенетических явлений, связанных с влиянием цитоплазмы. В то время как реципрокное оплодотворение генерирует в двух конъюгантах генетически идентичные зиготические ядра, между ними почти не происходит обмена цитоплазмой, что позволяет эффективно различать действие ядерных генов от действия наиболее влиятельного фактора внешней среды — цитоплазмы материнской клетки (рис. 7.2). Каждое генетическое скрещивание поэтому эквивалентно изучению монозиготных близнецов, рожденных разными матерями. Исследования Соннеборна показали, что фенотипические различия между двумя родительскими клетками могут поддерживаться у потомков каждой из них даже несмотря на то, что эти потомки обладают идентичными генотипами. Позже оказалось, что в ряде случаев эти фенотипические различия детерминируются экстрануклеарными генами и сегодня не должны квалифицироваться как эпигенетические явления. Например, смертоносные свойства киллерных штаммов P. aurelia обусловлены обитающими в цитоплазме эндосимбиотическими бактериями рода Caedibacter; которые выделяют токсин, убивающий чувствительные штаммы (обзоры см. Preer et al., 1974; Pond et al., 1989). Другие случаи, такие как материнское наследование серотипа, которое требует взаимно исключающую экспрессию одного из нескольких паралогичных генов поверхностных антигенов, являются четкими случаями цитоплазматического влияния на активность генов.

Рис. 7.2. Менделевская vs. цитоплазматическая наследственность

^{(а) Конъюгация и автогамия иллюстрируются скрещиванием между двумя клетками Paramecium, каждая из которых гомозиготна по разным аллелям, М или т. Конъюгация включает реципрокный обмен одним из двух идентичных гаметических ядер. В результате этого образуются клетки-эксконъюганты F1 с идентичными гетерозиготными генотипами. Автогамия (процесс самооплодотворения) генерирует полностью гомозиготный генотип всего в одном половом поколении, так что особи F2 имеют 50 %-ную вероятность стать М/М или m/m.}

^{(б) Фенотипическое различие между клонами F1 выявляет цитоплазматически наследуемые признаки. У Paramecium тип спаривания (О или Е) необратимо детерминируется в ходе развития соматического макронуклеуса (большой кружок) из тотипотентного микронуклеуса зародышевой линии (маленький кружок); однако родительский макронуклеус направляет дифференцировку каждого эксконъюганта в направлении сохранения существующего типа спаривания}

Как и серотипы, два комплементарных типа спаривания у P. tetraurelia, которые обозначаются как О и Е, демонстрируют цитоплазматический паттерн наследования. Признаки О и Е являются терминально дифференцированными фенотипами, которые детерминируются в ходе развития соматического макронуклеуса из тотипотентной зародышевой линии. После конъюгации вегетативный клон, происходящий от родителя О, почти всегда демонстрирует тип спаривания О, тогда как клон, происходящий от родителя Е, почти всегда относится к типу Е, несмотря на то, что оба этих эксконъюганта развиваются из идентичных зиготических геномов (рис. 7.26). Более того, когда между двумя конъюгируюшими клетками образуется большой цитоплазматический мостик, обусловливающий существенный обмен цитоплазмой, потомство обоих родителей обычно развивается как тип Е (Sonnebom, 1977). Таким образом, должен существовать некий цитоплазматический фактор, который направляет развитие типа Е.

Как описывается ниже, геном зародышевой линии во время развития макронуклеуса подвергается масштабным перестройкам ДНК, и хотя предполагаемый ген типа спаривания все еще не идентифицирован, было показано, что одна менделевская мутация, влияющая на детерминацию типа спаривания, нарушает эти перестройки генома в других локусах (Meyer and Keller, 1996). Если тип спаривания определяется регулируемыми геномными перестройками, этот цитоплазматический фактор, определяющий тип Е, должен обладать способностью направлять альтернативную перестройку гена типа спаривания и давать в результате макронуклеарную форму этого гена, специфицирующую тип Е. В ходе конъюгации эта форма должна также производить цитоплазматический фактор, определяющий тип Е и необходимый для дальнейшего наследования. Как описывается в разделе 10, паттерны альтернативных перестроек могут передаваться от материнских макронуклеусов к зиготическим макронуклеусам в результате транс-нуклеарного влияния, которое по-видимому опосредуется молекулами РНК, действующими зависящим от гомологии образом. Таким образом, цитоплазматический фактор, ответственный за неменделевское наследование, является, вероятно, молекулой РНК, контролирующей «мутацию» развития в гене типа спаривания.

4. Кортикальное паттернирование: случай структурной наследственности

Исследования сложной архитектуры клеточного кортекса обнаружили еще одну форму неменделевской наследственности. Клетка Paramecium покрыта примерно 4000 ресничками, расположенными в виде продольных рядов заякоренных ячеек (рис. 7.3а). Каждая ресничка коренится в базальном тельце, или кинетосоме, — сложной структуре, обладающей и передне-задней, и лево-правой асимметрией. Когда клетки делятся, структура цилиарных ячеек накладывает определенные ограничения на дупликацию базальных телец, так что новые базальные тельца остаются в той же самой ориентации (рис. 7.3б). Однако хирургическая пересадка небольшого участка кортекса в перевернутой ориентации (с обращенной полярностью) по мере дупликации пересаженных базальных телец приведет, в конечном счете, к образованию полностью перевернутого ресничного ряда (рис. 7.3в). Эта передне-задняя инверсия будет воспроизводиться в неограниченном числе вегетативных клеточных делений и будет наследоваться по материнской линии в ходе конъюгации (Beisson and Sonnebom, 1965).