Начальные методы клеточной биологии: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Научиться размораживать эукариотические клетки из криобанка и высевать их для субкультивирования. С помощью инвертированного микроскопа изучить морфологию клеток одной клеточной линии и сравнить с морфологией клеток других культур. Подготовить планшеты с клетками для проведения следующих лабораторных работ.

Введение

Культуры клеток для длительного хранения замораживают при низких температурах и депонируют в клеточных криобанках. Для начала работы с любой клеточной линией необходимо достать ее из криохранилища, где при температуре ниже –140 °C (в жидком азоте (–196 °C) или в его парах) она сохраняется в жизнеспособном состоянии. Провести процедуру оттаивания. Жизнеспособные клетки культивировать для проведения с ними экспериментов.

В организме человека клетки, как правило, располагаются плотно друг к другу, и для них характерны различные молекулы клеточной адгезии. Многие ученые и биотехнологические производства сегодня работают с культурами клеток, которые растут в прикрепленном – так называемом адгезивном – состоянии. Адгезия обеспечивается различными белками (вспомните из курса лекций какими). Для выращивания адгезионных линий используют специальную поверхность, к которой клетки могут прикрепиться. Для этого применяются флаконы различных модификаций, иногда с обработанной специальными веществами поверхностью. так, нижнюю поверхность флакона покрывают элементами внеклеточного матрикса, например коллагеном, чтобы повысить адгезию и улучшить стимуляцию роста и дифференцировку клеток, но это не всегда хорошо для эксперимента (предположите почему). Сейчас разработаны и используются разнообразные трехмерные подложки-носители естественного или искусственного происхождения для создания различных клеточных структур.

Рост адгезивной культуры внутри одного культурального флакона обычно соответствует зависимости, изображенной на рис. 5. Сразу после посева клеткам необходим период покоя, адаптации и прикрепления, который характеризуется медленным ростом – это lag-фаза. Затем клетки начинают активно делиться. Такой период быстрого экспоненциального роста с высокой метаболической активностью называется log-фаза. Для него характерна активная пролиферация клеток. Они истощают среду и занимают все большее пространство культурального флакона. Когда плотность клеток (количество на 1 см2 субстрата) достигает такого уровня, при котором все пространство оказывается занятым, рост прекращается или значительно снижается (фаза плато). Одна из причин этого – явление контактного ингибирования роста, связанное с запуском регуляторных каскадов, замедляющих или останавливающих деление при адгезии «клетка-клетка». При переизбытке клеток в культуре накапливаются продукты обмена, которые могут существенно влиять на пролиферацию. При стрессе и гибели клеток также выделяются различные вещества, воздействующие на биохимические процессы здоровых. В связи с этим избыточная концентрация клеток влияет на клеточный цикл – деление замедляется. Культура переходит в стационарную фазу, которая протекает для разных линий различно.

Для того чтобы поддерживать клетки в фазе роста, необходимо вовремя переносить часть их в новый флакон с заменой среды. Эта процедура называется пассированием или пересевом, единичный пересев – пассажем, а длительный процесс наращивания биомассы активно пролиферирующих клеток – субкультивированием. Подробное описание базовых методов культивирования адгезионных и суспензионных клеточных линий можно найти в учебнике «Культура животных клеток» [Фрешни, 2010].

Рис. 5. Фазы роста культуры при ее поддержании. Количество клеток во флаконе указано ориентировочно, поскольку может значительно различаться для разных клеточных линий. Овалом на графике приблизительно обозначен рекомендуемый период для субкультивирования. 1 – lag-фаза; 2 – фаза экспоненциального роста (log-фаза); 3 – фаза плато

Схематично субкультивирование адгезионных клеток представлено на рис. 6.

При культивировании клеток в течение нескольких дней без пересева необходимо несколько раз в неделю производить смену среды. Для пересева клеток в новый флакон их необходимо открепить от поверхности. Процесс отделения (диссоциации) клеток зависит от свойств культуры, метода культивирования (различные виды носителей) и требований конкретного эксперимента. Для открепления клеток чаще всего используется обработка пептидазами, однако их нельзя применять, если необходимо сохранить поверхностные белковые компоненты клеток. В таком случае клетки можно открепить механически с помощью специального скребка. Далее в ходе выполняемой работы для снятия клеток с подложки будет использоваться раствор трипсина с ЭДТА.

Рис. 6. Субкультивирование монослойной культуры клеток: 1 – клетки покрывают поверхность флакона – конфлюэнтный монослой; 2 – удаление среды; 3 – промывка фосфатно-солевым буфером или раствором Версена; 4 – добавление диссоциирующего раствора, инкубация; 5 – клетки округлились, межклеточные контакты нарушены; 6 – открепление клеток; 7 – суспензия клеток; 8 – инактивация диссоциирующего раствора и центрифугирование для замены инактивированного диссоциирующего раствора на среду; 9 – рассев на несколько флаконов; 10 – новый этап культивирования клеток

После открепления необходимо охарактеризовать полученную суспензию клеток: провести их подсчет и оценить целостность.

Для подсчета клеток обычно используют предметное стекло с бороздами и нанесенной микроскопической сеткой (деления 0,05 мм и 0,2 мм), в котором центральная часть несколько ниже боковых и объем над сеткой составляет 0,9 мкл. В варианте, называемом «камера Горяева», зазор от центральной части до опирающегося на боковые участки камеры покровного стекла составляет 0,1 мм.

Существует несколько формул для подсчета. Можно подсчитать количество клеток в 15 больших квадратах по диагонали, умножить на 15, получив количество клеток в объеме над сеткой, и разделить на 0,9: получится количество клеток в 1 мкл. Умножив это значение на 1000, получим концентрацию клеток в миллилитре.

В более классическом варианте общее число клеток N подсчитывают под микроскопом над 25 обозначенными серым цветом квадратами на сетке камеры (рис. 7); количество клеток вычисляют по формуле:

C = N × 104 × V,

где N – количество клеток в серых квадратах; V – объем суспензии клеток в миллилитрах. Соответственно, при V = 1 получится концентрация клеток в миллилитре.

Существует огромное разнообразие автоматических счетчиков клеток, которые производят не только подсчет клеток, но и анализ их размера и целостности.

Пример автоматического счетчика (рис. 8) рассматривается на занятии, но в лаборатории можно встретить и другие приборы – их характеристики легко найти на сайте производителя. Отметим только, что в большинстве приборов используются одноразовые или многоразовые слайды, устроенные по типу камеры Горяева.

Рис. 7. Подсчет клеток в камере Горяева: А – камера Горяева – внешний вид стекла на предметном столике; Б – вид сетки на стекле в окуляре микроскопа; В – схема сетки

Рис. 8. А – автоматический счетчик клеток; Б – слайды, подобные камере Горяева

Материалы и оборудование

• Культуральный блок для работы с клетками млекопитающих.

• Эукариотические клетки из криобанка в криопробирках.

• Клетки клеточной линии глиомы U87MG или иные.

• Флаконы культуральные 25 см², на группу – от 5 шт.

• Полная питательная среда, приготовленная в ходе предыдущей работы, минимальный объем – 20 мл.