Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Гистоны упаковывают ДНК в нуклеосомные частицы, и эта архитектурная роль может объяснить тот факт, что гистоны составляют половину массы эукариотической хромосомы. Однако было также обнаружено, что гистоны играют многообразные роли в экспрессии генов, сегрегации хромосом, репарации ДНК и других базовых хромосомных процессах у эукариот. Специфические требования, предъявляемые этими хромосомными процессами, привели к развитию разных вариантов гистонов. Включение вариантного гистона в нуклеосому представляет потенциально глубокое изменение хроматина. Действительно, недавние работы показали, что некоторые варианты гистонов откладываются разными комплексами сборки нуклеосом, что позволяет предполагать, что хроматин диверсифицируется, по крайней мере частично, включением и замещением вариантов гистонов.

Четыре коровых гистона различаются в отношении их склонности диверсифицироваться в варианты. Например, у человека имеется только один изотип Н4, но несколько паралогов Н2А с разными свойствами и функциями. Очевидно, разное положение коровых гистонов в нуклеосомной частице подвергало их действию разных эволюционных сил, приводя к важным диверсификациям Н2А и H3, но не Н2В и Н4. Наличие геномных последовательностей от самых разнообразных эукариот позволяет нам сделать вывод, что эти диверсификации произошли в разное время в ходе эволюции эукариот. Однако явная диверсификация анцестрального белка «гистоновой свертки» (histone fold protein) в знакомые четыре коровых гистона должна была произойти на ранних этапах эволюции эукариотического ядра или даже, возможно, еще раньше. Рассматривая эти древние события, мы узнаем о тех силах, которые привели к последующей диверсификации в современные варианты.

2. Эукариотические коровые гистоны развились из гистонов архей

Эукариотическая нуклеосома представляет собой сложную структуру, состоящую из октамера четырех коровых гистонов, обернутого почти два раза ДНК; «хвосты» гистонов и линкерные гистоны опосредуют разнообразные упаковочные взаимодействия вне коровой частицы (Arents et al., 1991; Wolffe, 1992; Luger et al., 1997). Нуклеосомы архей гораздо проще, и очевидно, что они похожи на анцестральную частицу, из которой развились эукариотические нуклеосомы (Malik and Henikoff, 2003). Нуклеосома архей состоит из белков с доменом «гистонового сворачивания» (histone fold domain proteins), которые не имеют «хвостов» и образуют тетрамерную частицу, обернутую лишь одним витком ДНК. Родство между нуклеосомами архей и эукариот можно видеть, сравнивая их структуры: остов [backbone] тетрамера архей почти накладывается на остов тетрамера (H3•Н4)₂ (рис. 13.1). Когда нуклеосомы архей реконструируются и формируют хроматин, получающаяся фибрилла ведет себя подобно «тетрасомам» (H3•Н4). Поэтому полагают, что эукариотические нуклеосомы развились из нуклеосом архей путем добавления димеров Н2А•Н2В с каждой стороны тетрасомы, чтобы сделать возможным второй виток ДНК, и путем приобретения гистоновых «хвостов». Кроме того, ДНК сворачивается в правую суперспираль вокруг коров архей, но в левую суперспираль вокруг эукариотических коров.

Дальнейшее проникновение в происхождение эукариотических нуклеосом становится возможным благодаря изучению субъединичных структур нуклеосом архей. В то время как большинство гистонов архей являются недиффернцированными мономерами или дифференцированы в структурно взаимозаменяемые варианты, которые сходятся вместе и формируют тетрамер, некоторые из них представляют собой димерные слияния типа «голова к хвосту», которые сходятся вместе и образуют димер из слившихся димеров (рис. 13.1). Когда два из этих слившихся димеров собираются в нуклеосомную частицу каждый член слившейся пары находится в структурно различимой позиции. Занимая различные позиции в частице, каждый член слившегося димера архей развивается независимо, давая ему возможность адаптироваться к одной позиции в нуклеосомной частице. Напротив, мономеры, занимающие взаимозаменяемые позиции, не обладают свободой для адаптации к определенным позициям. Действительно, два члена димеров архей дивергировали друг от друга в обеих независимых линиях, в которых они обнаруживаются. Этот процесс представляет возможный сценарий дифференцировки анцестрального белка с доменом «гистонового сворачивания» (histone fold domain protein) в четыре различные субъединицы, занимающие различные положения в эукариотической нуклеосоме. Подобно их предполагаемым предкам у архей эукариотические гистоны образуют димеры, где Н2А димеризуется с Н2В, а H3 — с Н4 (который также стабильно тетрамеризуется в растворе). При разрешении 2 Е структурный остов (backbone) гистонового димера у архей накладывается на остовы Н2А•Н2В и H3•Н4, причем первый член этого димерного повтора накладывается на Н2А или H3, а второй член — на Н2В или Н4. Поэтому, хотя у всех четырех эукариотических гистонов отсутствует сколько-нибудь существенное сходство по нуклеотидной последовательности друг с другом и с гистонами архей, это поразительное структурное наложение димерных единиц заставляет предполагать, что эукариотические гистоны развились и дифференцировались из более простых предков, бывших у архей.

Рис. 13.1. Модель эволюции эукариотической нуклеосомы из предкового дублетного гистона (doublet histone ancestor) архей

^{Тетрамер архей с взаимозаменяемыми субъединицами А и В (А/В) мог развиться в димер слившихся димеров («дублет»). За этим могло бы следовать расшепление [split] гена, чтобы дать начало эукариотическому тетрамеру H3 и Н4, формирующему «тетрасому» (H3•Н4), которая занимает один виток ДНК. Н2А и Н2В могли возникнуть в результате аналогичного события, собираясь над тетрамером и под ним, как предполагается на рисунке, в результате чего становятся возможными два витка ДНК (не изображено). Одиночные точки в верхней части диаграммы изображают контакты димеров, а двойные точки — четырехспиральные пучки между соседними димерами (Перепечатано из: Malik and Henikoff 2003)}

Асимметрия димеров Н2А•Н2В и H3•Н4, происходящая. по-видимому, от тандемных димеров архей. могла проложить путь для последующей диверсификации вариантов эукариотических гистонов. И Н2А. и H3 соответствуют первому члену тандемных гистоновых димеров у архей, и оба впоследствии многократно диверсифицировались в эволюции эукариот. Напротив, Н2В и Н4 соответствуют второму члену и продемонстрировали очень незначительную функциональную диверсификацию (Н2В) или вовсе никакой (Н4). И H3, и Н2А образуют гомодимерные контакты в октамере (рис. 13.2), тогда как Н4 и Н2В контактируют лишь с другими гистонами. В результате изменения в остатках, вовлеченных в гомодимеризацию либо Н2А, либо H3, могут потенциально сопротивляться образованию смешанных октамеров, позволяя нуклеосомам, содержащим вариант Н2А или H3, развиваться независимо от родительских нуклеосом. Например, четырехспиральный пучок (four-helix bundle), охватывающий интерфейс между молекулами H3, определяет левостороннее суперскручивание ДНК вокруг нуклеосомы (Arents et al., 1991; Luger et al., 1997), тогда как в нуклеосомах архей супервитки ДНК являются правосторонними (Marc et al., 2002). Очевидно, мутация этого четырехспирального пучка у предка H3 была ответственна за эту реверсию. В целом структурные особенности, облегчавшие независимую эволюцию субъединиц, могли быть предпосылками для диверсификации нуклеосомных частиц.

Рис. 13.2. Локализация гистона Н3 (синий цвет) и Н2А (корич­ невый цвет) в коровой частице нуклеосомы

^{Четыре остатка, различающиеся у вариантов НЗ, показаны желтым цветом (перепечатано, с любезного разрешения, из: Henikoff and Ahmad 2005)}

Хотя мы можем дать рациональное объяснение происхождению эукариотических коровых гистонов от тандемных димеров архей, остаются другие основные вопросы. Откуда появились «хвосты» гистонов? Когда вышли на сцену Н2А•Н2В? Произошли ли эти события до, во время или после возникновения эукариотического ядра? Почему все известные нуклеосомы архей состоят из тетрамеров с одним витком, тогда как эукариотические нуклеосомы состоят из октамеров с двумя витками? Почему поменялось направление суперспирали? Возможно, изучение большего числа архей и м примитивных эукариот позволит обнаружить промежуточные формы, которые смогут дать ответ на эти вопросы.

3. Основная масса гистонов откладывается после репликации ДНК

Для упаковки по существу всей ДНК эукариотической клетки в нуклеосомы необходимо, чтобы хроматин дуплицировался, когда реплицируется ДНК (рис. 13.3). Таким образом, канонические гистоны продуцируются в фазе синтеза ДНК клеточного цикла (фазе S). Сопряжение синтеза гистонов с синтезом ДНК в фазе S находится под строгим контролем клеточного цикла (Marzluff and Duronio, 2002). Это особенно очевидно у животных, где специальный процессинг гистоновых транскриптов малым ядерным рибонуклеопротеидным комплексом U7 и стабилизация иРНК белком SLBP (stem-loop-binding protein) вносят вклад в тесную координацию синтеза гистонов с репликацией ДНК. Весьма вероятно, что необходимость в быстром и массивном производстве гистонов в фазе S ответственна за тот факт, что сопряженные с репликацией (RC, replication-coupled) гистоны у животных закодированы в кластерах, содержащих много гистоновых генов.Например, в геноме человека имеется 14 генов Н4, большинство из которых находятся в двух главных кластерах, где эти гены Н4 чередуются с генами других гистонов RC (Marzluff et al., 2002). У животных гистоны RC узнаются по наличию 3’-последовательности длиной 26 п.о., которая образует структуру «стебель-петля (stem-loop)» для распознавания комплексом SLBP при транскрипции в гистоновую иРНК. Канонические гистоны растений тоже кодируются множественными генами и откладываются в фазе S, хотя транскрипты растительных гистонов полиаденилированы, а аналог SLBP, по-видимому, отсутствует.

В той мере, в какой эпигенетическая наследственность является результатом наследования «состояния» хроматина, процесс сборки нуклеосом RC представляет исключительный интерес. Биохимия этого процесса была выяснена, когда были разработаны системы in vitro, способные собирать нуклеосомы на реплицирующейся ДНК. Эти исследования показали, что трех-субъелиничный комплекс, фактор сборки хроматина I (CAF-I, chromatin assembly factor I) действует как гистоновый шаперон, облегчающий включение H3•Н4 в качестве первого этапа сборки нуклеосом (Loyola and Almouzni, 2004). Было показано, что CAF-1 взаимодействует с фиксатором репликационной процессивности (replication processivity clamp), PCNA, что означает, что репликация ДНК и сборка RC происходят в тесной близости. Работы на почкующихся дрожжах показали, что ни одна из субъединиц комплексов, участвующих в сборке RC in vitro, не является существенной для роста; это позволяет предполагать, что in vivo существуют избыточные механизмы для сборки RC. Тот факт, что большая часть хроматина дрожжей собирается независимым от репликации (RI, replication-independent) образом (Altheim and Schultz, 1999), дает разумное объяснение для этой явной избыточности. Как показано ниже, варианты гистонов, как правило, откладываются путем RI-сборки нуклеосом.

Рис. 13.3. Старые нуклеосомы (темные диски) случайно распределяются позади репликационной вилки, а новые нуклеосомы (светлые диски) откладываются в образующиеся бреши

^{Опосредованная CAF-1 сборка нуклеосом изображена, с увеличением, на ведущей и отстающей нитях. ДНК-полимераза (зеленый цвет); фиксатор поступательного хода репликации, PCNA (синее кольцо); тетрамеры гистонов H3•Н4 (розовый цвет); вновь синтезированная ДНК (красный цвет)}

У почкующихся дрожжей RC-сборка не является полностью избыточной. Интригующим оказалось открытие, что отсутствие большой субъединицы CAF-1 ведет к утрате эпигенетического сайленсинга в теломерах (Loyola and Almouzni, 2004). Эта связь между RC-сборкой и эпигенетическим сайленсингом была распространена и на Arabidopsis, где утрата субъединиц CAF-1 приводит к ряду дефектов, которые можно приписать утере эпигенетической памяти. Хотя механистическая основа этих наблюдений неизвестна, кажется очевидным, что правильная откладка новых нуклеосом позади репликационной вилки важна для поддержания эпигенетически сайленсированного состояния.

Предпосылкой эпигенетической наследственности нуклеосомного состояния является тот факт, что предсуществовавшие нуклеосомы после репликации должны быть распределены по дочерним хроматидам (рис. 13.3). Действительно, так оно и есть: детальные исследования показали, что старые нуклеосомы наследуются дочерними хроматидами интактными и очевидно случайным образом (рис. 13.3) (Annunziato, 2005). Однако этот процесс наследования плохо понят, как и процесс, посредством которого новые гистоны могли бы приобретать эпигенетическую информацию. Популярная модель состоит в том, что новые нуклеосомы модифицируются в результате того, что они находятся вблизи старых нуклеосом (Jenuwein, 2001), однако данные в пользу этого гипотетического процесса отсутствуют, и необходимо рассматривать альтернативные средства воспроизведения эпигенетического состояния (Henikoff and Ahmad, 2005). Каким образом эпигенетическая информация наследуется дочерними клетками, остается главным невыясненным вопросом биологии, и изучение вариантов гистонов и механизмов их откладки может дать ответ на этот вопрос

4. Варианты гистонов откладываются на протяжении всего клеточного цикла

Как мы видели, коровые гистоны можно классифицировать на основе их анцестральной последовательности и положения в нуклеосоме. Линкерные гистоны характеризуются доменом winged helix, а не доменом histone fold, и связываются с линкерной ДНК, разделяющей нуклеосомы (Wolffe, 1992). Хотя существуют минорные варианты этих канонических гистонов, они оказываются взаимозаменимыми с основной формой. Например, Н3.1 и Н3.2 различаются одной аминокислотой, и не известно, чтобы это придавало разные биологические свойства этим двум изоформам. Существование множественных генов, производящих большие количества канонических гистонов для откладки в фазе S, является типичным для эукариотических геномов. Почти повсеместная встречаемость и подавляющее изобилие канонических S-фазных гистонов привело к тому, что до последнего времени вариантам гистонов уделяли относительно мало внимания.

Возрождение интереса к вариантам гистонов явилось отчасти результатом осознания, что они отличаются от канонических S-фазных гистонов таким образом, что это может приводить к глубокой дифференцировке хроматина. Одно из различий между ними — различие в способе их включения в хроматин. RC-сборка вставляет новые нуклеосомы в бреши между старыми нуклеосомами по всему геному, тогда как RI-сборка связана с локальным замещением существующей нуклеосомы или субъединицы (Marzluff et al., 2002). Поэтому RI-сборка потенциально способна переключать состояние хроматина путем замещения канонического гистона его вариантом. Замещение одного гистона другим могло бы также стирать или изменять паттерн посттрансляционных модификаций. Следовательно, RI-сборка потенциально способна «перезагружать» эпигенетические состояния, которые, как полагают, опосредуются гистонами и их модификациями. Недавние успехи в изучении вариантов гистонов и процессов, с помощью которых они откладываются, привели к углублению наших представлений об основах эпигенетической наследственности и ремоделинга. Ниже мы обсудим особенности конкретных вариантов гистонов, обусловливающие их вклад в дифференцировку хроматина и, возможно, связанные с воспроизведением эпигенетической информации.

5. Центромеры идентифицируются специальным вариантом H3

Определяющей особенностью эукариотической хромосомы является центромера, которая служит местом прикрепления микротрубочек веретена во время митоза. Первыми центромерами, описанными на молекулярном уровне, были центромеры почкующихся дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), где последовательность длиной 125 п.о. необходима и достаточна для формирования центромеры (Amor et al., 2004а). Однако центромеры растений и животных очень различаются, состоя, как правило, из мегабазных порядков коротких тандемных повторов. В отличие от ситуации с почкующимися дрожжами роль нуклеотидной последовательности ДНК в этих сложных центромерах неясна, поскольку известно, что полностью функциональные неоцентромеры образуются у человека спонтанно в эктопических сайтах, полностью лишенных последовательностей, похожих на центромерные повторы (рис. 13.4). Эти и другие наблюдения говорят против прямой роли последовательности ДНК в определении локализации центромер (глава 6)

Ключевое проникновение в идентичность и наследование центромер пришло в результате идентификации варианта гистона H3, CENP-A (рисунок в начале главы). который оказался специфически локализованным в центромерах и включенным в нуклеосомные частицы вместо самого H3 (Palmer et al., 1991). Замечательно, что CENP-A остается связанным с центромерами при переходе от гистонов к протаминам во время сперматогенеза, когда, в сущности, все другие гистоны утрачиваются (Palmer et al., 1990). Это раннее наблюдение в исследовании CENP-A позволяет предполагать, что CENP-A вносит вклад в центромерную идентичность мужского генома. Общее значение этого факта не было полностью оценено, пока не осознали, что CENP-A является гораздо более хорошим маркером для центромер, чем нуклеотидная последовательность ДНК (Armor et al., 2004а), и что аналоги CENP-A можно найти в геномах всех эукариот (рис. 13.5) (Malik and Henikoff, 2003). Таким образом, хотя центромеры почкующихся дрожжей определяются по консенсусной последовательности длиной 125 п.о., это также сайт центромерной нуклеосомы, который содержит вариант Cse4 центромерного H3 (CenH3). У дробянковых дрожжей (Schizosaccharomyces pombe) группа содержащих CenH3 нуклеосом занимает центральный коровый район центромеры, фланкированный содержащими H3 нуклеосомами, обнаруживающими характерные черты гетерохроматина (Armor et al., 2004а). У мух и позвоночных CenH3s присутствуют в виде порядков [arrays], чередующихся с содержащими H3 порядками, которые демонстрируют уникальный паттерн модификаций гистонов (Sullivan and Karpen, 2004). Чередование может объяснять тот факт, что центромеры занимают лишь внешний край центромерной перетяжки метафазных хромосом (рисунок в начале главы) Это согласуется с наблюдением, что у «голокинетических» хромосом червей микротрубочки прикрепляются по всей длине каждой анафазной хромосомы, а CenH3 занимает ведущий край по всей ее длине (рис. 13.5, справа) (Malik and Henikoff, 2003). Действительно, оказалось,что уникальный вариант CenH3 точно маркирует центромеру у всех изученных в этом отношении эукариот. Эта очевидная повсеместность и присутствие центромер для осуществления митоза у всех эукариот указывает на возможность происхождения первого канонического H3 из CenH3.

Рис. 13.4. Неоцентромеры человека (указаны стрелками) лишены центромерной ?-сателлитной ДНК, но имеют CENP-A и гетерохроматин

^{AHTH-CENP-A-окрашивание зеленым цветом и анти-CENP-B-окрашивание красным цветом (который маркирует ?-сателлитную ДНК) идентифицируют неоцентромеру хромосомы 4, которая лишена ?-сателлита (основная часть рисунка) Эта хромосома 4 в остальных отношениях нормальна и передавалась на протяжении, по крайней мере, трех мейотических поколений нормальных особей Врезка изображает анти-НР1-окрашивание, которое показывает, что несмотря на отсутствие сателлитной ДНК гетерохроматин формируются вокруг активных неоцентромер. (Перепечатано, с любезного разрешения, из: Armor et al., 2004b [©National Academy of Sciences])}