Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

8. H2AZ играет роль в регулировании транскрипции

Возрождение интереса к вариантам гистонов оказалось особенно мощным в случае H2AZ (или H2A.Z) (Karnakaka and Biggins, 2005). H2AZ почти повсеместен; он дивергировал от анцестрального Н2А на ранних этапах эволюции эукариот. В соответствии с этим отдельным происхождением генетические эксперименты с почкующимися дрожжами и мухами показали, что гистоны Н2А и H2AZ возникли для выполнения отдельных, неперекрывающихся функций. H2AZ является необходимым гистоном у большинства организмов, от ресничных простейших до млекопитающих. Однако почкующихся и дробянковых дрожжей делеция гена H2AZ дает жизнеспособные клетки, хотя эти нуль-мутанты обладают разнообразными фенотипами. Эти свойства облегчили его генетическую и биохимическую характеристику у дрожжей.

У большинства протестированных на сегодня организмов H2AZ составляет приблизительно 10 % от общего белка Н2А. Он широко, но не однородно распределен по всем хромосомам. Это наиболее элегантно выглядит в случае политенных хромосом Drosophila, где он образует отчетливый паттерн бэндинга. Результаты опытов по иммунопреципитации хроматина с использованием дрожжевых и мышиных клеток согласуются с этим паттерном. Хотя H2AZ преимущественно локализуется в промоторных участках генов дрожжей, эта специфичность не соблюдается для всех сайтов его откладки. У Drosophila сколько-нибудь различимая связь между локализацией H2AZ и экспрессией генов отсутствует. Таким образом, хотя механизм откладки H2AZ известен (обсуждается ниже), правила, определяющие места его концентрации, в настоящее время неясны.

Ряд наблюдений указывают на важную роль в регулировании экспрессии генов (Kamakaka and Biggins, 2005). Мутационный анализ почкующихся дрожжей показал, что функция H2AZ частично является избыточной с двумя разными классами глобальных транскрипционных факторов, комплексом ремоделинга нуклеосом, Swi/Snf, и комплексом модификации гистонов, SAGA. Хотя утрата по отдельности функции H2AZ, Swi/Snf или SAGA не лишает клетку жизнеспособности, одновременная потеря любой комбинации двух путей детальна. Дополнительные генетические и биохимические эксперименты позволяют предположить, что эта роль включает и функции как в инициации, так и в элонгации транскрипции (дополнительные детали см. в главе 10). Более того, баланс откладки H2AZ причинно связан с эпигенетикой через его роль как фактора антисайленсинга Делеция гена H2AZ приводит к экстенсивному распространению «молчащего» хроматина внутрь от теломер, и этот дефект может быть подавлен дополнительной делецией генов, кодирующих сами факторы сайленсинга (рис. 4.7). Влияние делетирования H2AZ на глобальную экспрессию генов было протестировано с помощью микрочипов дрожжевых генов. Хотя большинство регулируемых генов обнаруживают пониженную экспрессию в нуль-мутантах по H2AZ, существенная доля их демонстрирует увеличение экспрессии. Поскольку все еще не ясно, какие изменения отражают прямую регуляцию, а какие — косвенную, возможно, что нуклеосомы H2AZ функционируют как позитивно, так и негативно в регулировании транскрипции генов. Более того, неизвестно, лежит ли в основе этих разнообразных ролей H2AZ в транскрипции и гетерохроматине один унифицирующий механизм или же более сложное сочетание разных путей.

В противоположность современной картине, полученной для почкующихся дрожжей, в клетках млекопитающих H2AZ предпочтительно локализуется в гетерохроматиновых участках. Действительно, было показано, что он физически взаимодействует с белком НР1 (Heterochromatin associated Protein 1) (Fan et al., 2004). Хотя это могло бы наводить на мысль о возможной роли H2AZ в сайленсинге у многоклеточных животных, следует отметить, что у Drosophila подгруппа экспрессируемых генов, локализованных в гетерохроматине, действительно нуждается в НР1 для экспрессии (Weiler and Wakimoto, 1995). Если локализация H2AZ в клетках млекопитающих отражает аналогичный процесс, тогда четко установленные роли этого варианта в облегчении транскрипции и противодействии сайленсингу у дрожжей вероятно отражали бы общие фундаментальные свойства этого варианта. H2AZ может играть еще одну роль в эпигенетике расхождения хромосом. Одним из первых фенотипов, обнаруженных у нуль-мутантов по H2AZ, был дефект расхождения хромосом в митозе, наблюдавшийся у дробянковых дрожжей. Последующие эксперименты сделали эту связь более очевидной. Экспериментальная делеция H2AZ в клетках млекопитающих с помощью РНК-интерференции (RNAi) вызывает дефекты в перицентрической ассоциации НР1, нестабильность генома и нарушения в сегрегации хромосом (Kamakaka and Briggins, 2005). Аналогичным образом, у почкующихся дрожжей нуль-мутанты по H2AZ обнаруживают повышенную частоту потери хромосом в митозе и существенные генетические взаимодействия с генами, кодирующими известные компоненты центромеры и митотического веретена (Krogan et al., 2004). Остается формально возможным, что влияние H2AZ на расхождение хромосом является косвенным следствием его роли в установке программы транскрипции генов. Однако интригующая гипотеза заключается в том, что механизмы расхождения хромосом эволюционировали таким образом, чтобы использовать не только вариант H3, но и вариант Н2А.

Каким образом H2AZ влияет на транскрипционную компетентность, сайленсинг, гетерохроматин и, возможно, сегрегацию хромосом? Структура содержащей H2AZ нуклеосомы, полученная с высоким разрешением, позволяет выявить несколько уникальных свойств этого варианта (Suto et al., 2000). По сравнению с нуклеосомами Н2А H2AZ обладает расширенным кислотным пэтч-доменом на поверхности нуклеосомы, и это отличие, вероятно, имеет функциональное значение. Например, у Drosophila именно часть «докинг-домена» («docking domain») (рис. 13.2) взаимодействует с гистоном Н4 и определяет сегмент, существенный для функции. Далее, результаты мутационных исследований и экспериментов по связыванию in vitro свидетельствуют о том, что этот расширенный кислотный пэтч вносит основной вклад во взаимодействие нуклеосомы с НР1 (Dryhurst et al., 2004). Интересно, что НР1 содержит хромодомен, белковый мотив, который может связываться с H3, метилированным по лизину 9 (главы 3 и 4). Таким образом, Н2А2может действовать совместно с метилированием гистона H3, обеспечивая ассоциированным с хроматином белкам платформу для связывания. В дополнение к своему расширенному кислотному пэтчу H2AZ имеет пару остатков гистидина, координирующих дополнительный ион металла в этой структуре, который, in vivo, мог бы обеспечивать уникальный физиологический ответ, недоступный нуклеосомам, содержащим Н2А. Наконец, кристаллическая структура позволяет предсказать, что асимметричный гистоновый октамер, состоящий из одного главного димера Н2А•Н2В плюс одного вариантного димера H2AZ•Н2В, создавал бы конфликт белковых структур в петле 1 (рис. 13.2) и, по-видимому, вряд ли происходит in vivo.

В совокупности эти новые особенности нуклеосом H2AZ свидетельствуют в пользу того, что этот вариант должен придавать хроматину уникальные физические свойства. Это предсказание подтверждается экспериментально. Например, H2AZ может стабилизировать димертетрамерные взаимодействия в нуклеосоме, и порядки нуклеосом, составленных из нуклеосом H2AZ, могут обнаруживать усиленное сворачивание более высокого порядка и уменьшенную межмолекулярную агрегацию (Dryhurst et al., 2004). Таким образом, H2AZ, вероятно, модулирует функцию хроматина по меньшей мере тремя различными способами. Во-первых, он несомненно изменяет физические свойства своего хроматинового окружения, влияя таким образом на доступность или активность trans-действующих факторов. Во-вторых, как и в случае с другими гистонами, посттрансляционные модификации в его аминотерминальном и карбокситерминальном доменах, вероятно, обеспечивают уникальные docking-сайты для ассоциированных с хроматином белков (так называемые эффекты, с которыми мы познакомились в главе 3), или регулируемые изменения в плотности заряда (cis-эффекты). В-третьих, его ограниченная и специфическая откладка в хроматине, вероятно, «нацеливает» уникальные функции на специфические локусы.

9. Белковые комплексы для откладки и замещения вариантов Н2А

Хотя все еще остаются важные вопросы относительно того, как варианты гистона Н2А функционируют, недавние исследования выяснили основу их включения в хроматин. Первый прорыв совершился, когда был биохимически очищен комплекс, катализирующий перенос димеров Н2А•Н2В в хроматин (Sarma and Reinberg, 2005). Этот мультисубъединичный комплекс, названный SWR1-C, содержит в качестве каталитической субъединицы белок Swrl, член семейства SWI/SNF FNA-зависимых ремоделеров хроматина. In vivo SWR1 -С, оказывается, предназначен для этой работы, потому что эффекты делетирования гена SWR1 сходны с эффектами делетирования гена, кодирующего сам H2AZ. Более того, у нуль-мутанта по swrl предпочтительная откладка H2AZ в специфических локусах полностью утрачена. In vitro, когда очищенный SWR1-C представлен с набором нуклеосом, он специфически замещает димеры Н2А•Н2В димерами H2AZ•Н2В в АТФ-зависимой реакции (рис. 11. Эволюция многих гистонов была направлена на более плотную упаковку ДНК

13.7). Интересный аспект этой реакции вытекает из предсказания кристаллической структуры, упомянутой выше: смешанные нуклеосомы, содержащие и Н2А, и H2AZ, не должны быть стабильными. Таким образом, замещение димера, опосредованное SWR1-C, может быть совместной реакцией, в которой замещение одного димера H2AZ•Н2В облегчает извлечение и замещение остающегося димера Н2А•Н2В.

Второй мультисубъединичный белковый комплекс выполняет у Drosophila замещение фосфорилированного Н2АХ нефосфорилированной молекулой (Morrison and Shen, 2005). Замечательно, что этот единственный у Drosophila комплекс, названный dTip60, состоит из белков, обычно обнаруживаемых в двух отдельных комплексах: SWR1-C, АТФ-зависимом комплексе ремоделирования хроматина, описанном выше, и NuA4/Tip60, комплексе модификации гистонов с ацетилтрансферазной активностью. In vitro эта реакция требует и АТФ. и ацетил-СоА. Таким образом, один этот комплекс интегрирует ацетилирование гистонов, ремоделинг нуклеосом и замещение гистонов их вариантами. Это сочетание вероятно отражает тот факт, что Н2АХ Drosophila является также ее H2AZ, тогда как у других эукариот Н2АХ эволюционировал из канонического Н2А. Несмотря на это различие, есть основания ожидать, что основной путь консервативен. У почкующихся дрожжей и в клетках млекопитающих SWR1-C, NuA4/ Tip60 и еще один АТФ-зависимый комплекс ремоделинга нуклеосом, INO80-C, имеют общие субъединицы. Одной из них является родственный актину белок Агр4. Интересно, что было показано, что у почкующихся дрожжей Агр4 взаимодействует с фосфорилированным Н2АХ, результатом чего является последовательное рекрутирование комплексов NuA4, SWR1 и INO80 (Downs et al., 2004). Это позволяет предполагать, что и у этих организмов эти комплексы катализируют замещение как Н2АХ, так и H2AZ. Остается продемонстрировать это предсказание непосредственно.

Открытие того, что комплексы ремоделинга хроматина предназначены для RI-сборки нуклеосом, важно не только для понимания того, как варианты гистонов включаются, но и для обеспечения первых специфических in vivo функций для машин ремоделинга хроматина. До этих открытий было неясно, почему клетки обычно имеют такое обилие крупных машин, облегчающих движение нуклеосом (Becker and Horz. 2002). Разнообразие АТФаз SWI/SNF представляло загадку, которую теперь, возможно, легче понять, если некоторые машины ремоделинга предназначены для сборки разных вариантов в нуклеосомы. Возможно, сборка нуклеосом является согласованным процессом, в котором ферменты, модифицирующие гистоны, действуют на свои субстраты, в то время как АТФ-зависимые ремоделеры обеспечивают рабочий ход и специфичность, необходимые для RI-замещения

10. Другие варианты Н2А дифференцируют хроматин, но их функции все еще неизвестны

Дальнейшая диверсификация Н2А произошла у позвоночных. У млекопитающих macroH2A и H2A^Bbd (Н2А Barr body deficient) представляют уникальные линии, которые, по-видимому, играют роль в эпигенетическом феномене компенсации дозы (детально обсуждается в главе 17). МасгоН2А называется так потому, что, кроме домена histone fold и карбокситерминальных «хвостов», он содержит большой карбокситерминальный глобулярный домен (Ladurner, 2003). С учетом того, что карбокситерминальный «хвост» Н2А выходит поблизости от линкерной ДНК, возможно, что этот глобулярный домен взаимодействует с линкерами, «хвостами» H3 или с такими линкерными белками, как Н1 и белки HMG (High Mobility Group). В чем именно заключается это взаимодействие — неизвестно, хотя интригующая возможность заключается в том, что оно обладает ферментативной активностью. В пользу этой возможности говорит сходство глобулярного домена (имеющего длину, 200 аминокислотных остатков) с белками, обладающими гидролитической активностью по отношению к полинуклеотидам и полипептидам. Другая возможность заключается в том. что глобулярный домен может просто действовать как препятствие для инициации транскрипции; на мысль о такой роли наводит его способность блокировать связывание транскрипционных факторов in vitro (Sarma and Reinberg, 2005). Домен histone fold macroH2A также обладает специфическими свойствами, поскольку он не действует на ремоделеры хроматина. Эти наблюдения позволяют предполагать, что нуклеосомы, содержащие macroH2A, менее мобильны и потому могут быть устойчивыми к активной транскрипции. Это могло бы объяснить обогащенность дискретных районов факультативно неактивной Х-хромосомы вариантом macroH2A у женщин — районов, которые чередуются с участками конститутивного гетерохроматина (рис. 13.9а) (Chadwick and Willard, 2004).

В противоположность macroH2A H2A^Bbd, по-видимому, не выявляется на тельце Бара, но в остальном наблюдается повсеместно в ядре (рис. 13.96) (Chadwick and Willard. 2001). Поведение in vitro нуклеосом, содержащих H2A^Bbd, согласуется с предположением, что он играет роль в облегчении транскрипции (Sarma and Reinberg, 2005). H2A^Bbd является быстро эволюционирующим белком по сравнению с другими известными изоформами Н2А, хотя причины этой ускоренной эволюции неясны.

11. Эволюция многих гистонов была направлена на более плотную упаковку ДНК

Когда больше нет необходимости получать доступ к ДНК для репликации и транскрипции, хроматин обычно становится еще более конденсированным, и это нередко связано с замещением канонических гистонов. Это очевидно для спермиев, и в некоторых линиях у паралогов гистонов выработалась специализированная роль упаковщиков. Например, сперии морского ежа содержат варианты Н1 и Н2В с повторяющимися «хвостовыми» мотивами, связывающимися с малой бороздкой ДНК (Malik and Henikoff, 2003), что предположительно является адаптацией к тому, чтобы более плотно упаковать хромосомы для включения в головки спермиев. Аналогичная адаптация обнаруживается у специфичных для пыльцы вариантов Н2А у цветковых растений, У позвоночных специфичные для спермиев специализированные варианты гистонов обнаруживаются в семенниках млекопитающих, в том числе паралог Н2В (SubH2Bv), локализующийся в акросоме, и специфичный для семенников вариант H3 (Witt et al., 1996).

Рис. 13.9. Варианты Н2A и неактивная Х-хромосома у женщин

^{(а) macroH2A (красный цвет) окрашивает дискретные районы неактивной Х-хромосомы, которые чередуются с маркером гетерохроматина (гистоном H3K9me3). (б) H2ABbd (зеленый цвет) исключается из неактивной Х-хромосомы (красная точка с указывающей на нее стрелкой), (в) То же самое ядро, что и на б, но окрашенное DAPI, чтобы показать хроматин (а — перепечатано, с любезного разрешения, из: Chadwick and Willard, 2004 [© National Academy of Sciences]; б, в — перепечатано, с любезного разрешения, из: Chadwick and Willard, 2001 [©The Rockefeller University Press])}

Замещение гистонов во время созревания спермиев протаминами и другими белками обеспечивает потенциальные средства для стирания эпигенетической информации в мужской зародышевой линии. Однако данные о трансгенерационной наследственности (Rakyan and Wbitelaw, 2003), особенно у животных, у которых нет метилирования ДНК, указывают на то, что некоторая выборка нуклеосомных гистонов, возможно, сохраняется при этом переходе и передает эпигенетическую информацию Как уже указывалось, это именно то, что происходите CENP-А в центромерах (Palmer et al., 1990), и возможно, что небольшая фракция других вариантов, таких как H3.3, остается в спермиях для эпигенетического наследования информации об экспрессии генов. Хотя наше понимание о процессе замещения гистонов в ходе развития спермиев является рудиментарным, мы надеемся, что многое удастся узнать, когда мы поймем, каким образом CENP-A переживает этот переход.

Увеличенная компактизация происходит также в соматических клетках, прекративших деления и претерпевающих дифференцировку. В некоторых случаях компактизация включает количественные и качественные изменения в линкерных гистонах. Стоихиометрия гистона Н1 относительно нуклеосом определяет средний интервал в нуклеосомных порядках in vivo (Fan et al., 2003). Кроме того, присутствие HI в хроматине способствует формированию структуры более высокого порядка, которая обычно подавляет транскрипцию (Wblffe, 1992). Линкерные гистоны in vivo гораздо более мобильны, чем коровые гистоны. Время пребывания [residence times] для Н2А и Н2В — часы, а для H3 и Н4 оно даже не может быть измерено, тогда как время пребывания для Н1 — несколько минут (Phair et al., 2004). В результате крайне мало вероятно, что включение вариантных линкерных гистонов дифференцирует хроматин наследуемым образом. Скорее, роль вариантов Н1, как полагают, сводится к тому, чтобы изменять свойства основной массы хроматина, которые могут влиять на компактизацию (Wblffe, 1992).

Варианты Н1 разделяют с коровыми гистонами разграничение между RC- и RI-формами (Marzluff et al., 2002). RC-вариантные формы HI, по-видимому, взаимозаменяемы друг с другом — предположение, основывающееся на том факте, что нокаутные мыши, лишенные одного или двух из пяти RC-вариантов Н1, фенотипически нормальны (Fan et al., 2003). У птиц вариант линкерного гистона Н5 откладывается во время созревания эритроцитов, что сопровождает крайнюю степень компактизации ядра. Еще один вариант, который откладывается до высоких уровней в неделящихся клетках, — это Н1⁰, сильно дивергировавший от канонических форм. Сверхэкспрессия Н1⁰ делает хроматин менее доступным для нуклеаз, чем аналогичная сверхэкспрессия канонической формы. Обычное накопление Н1⁰ в неделящихся клетках могло бы быть общим механизмом компактизации хроматина, по мере того как клетки переходят в состояние покоя.

12. Заключение и перспективы исследований

Варианты гистонов обеспечивают наиболее фундаментальный уровень дифференцировки хроматина, и альтернативные механизмы откладки различных вариантов потенциально могут устанавливать и поддерживать эпигенетические состояния. Гистоны Н2А, Н2В, H3 и Н4 занимают разные положения в коровой частице в результате эволюционного процесса, начавшегося до появления последнего общего предка эукариот. Ключевые эволюционные инновации остаются неопределенными, в том числе возникновение октамера из анйцестрального тетрамера типа H3•Н4, и мы ожидаем секвенирование большего числа геномов архей и примитивных эукариот, которые могли бы оказаться отсутствующими связующими звеньями. Последующее усложнение четырех коровых гистонов в разные варианты обеспечило основу для эпигенетических процессов, включая развитие и расхождение хромосом. Для полного понимания эпигенетической наследственности нам нужно лучше понимать процессы включения вариантов путем замещения канонических гистонов. Важным достижением последнего времени является характеристика независимых от репликации путей сборки, предназначенных для конкретных вариантов.

Центромеры представляют собой наиболее бросающиеся в глаза примеры очень разного хроматина, которые можно приписать особым свойствам того или иного варианта гистона. Хотя ясно, что нуклеосомы, содержащие CenH3, образуют фундамент центромеры, главным вызовом для будущих исследований остается вопрос о том, каким именно образом они откладываются в одно и то же место в каждом клеточном поколении в отсутствие даже намека на сиквенс-специфичность.

Становится очевидным, что с вариантами гистонов связаны также эпигенетические свойства активных генов. Транскрипиионно активные локусы обогащены и H3 3, и H2AZ, и расшифровка процессов сборки, ответственных за это обогащение, представляет собой важную область текущих исследований. Динамическое поведение хроматина ведет к пониманию того, что транскрипция, ремоделинг хроматина и модификация гистонов могли бы быть сопряжены со сборкой и разборкой нуклеосом. Изучение динамических процессов, связанных с обновлением гистонов, находится лишь на ранней стадии, и мы ожидаем технологических достижений в молекулярной биологии, цитогенетике, биохимии и структурной биологии, которые можно будет использовать для лучшего понимания динамической природы хроматина.

Помимо этих универсальных процессов варианты гистонов участвуют и в конкретных эпигенетических явлениях. В случае Х-хромосомы млекопитающих три разных варианта Н2А, фосфо-Н2АХ, macroH2A и H2A^Bbd, рекрутированы для участия в сайленсинге или активации генов в целях инактивации зародышевой линии или компенсации дозы. Понимание функции этих вариантов в эпигенетических процессах остается важным вызовом на будущее

Получение первой структуры коровой частицы нуклеосомы с высоким разрешением (Luger et al., 1997) стало плодотворным достижением в выяснении свойств хроматина. Путем такого усложнения этой базовой структуры, которое имело биологические последствия, варианты гистонов дают возможность углубить наше понимание того, каким образом эти удивительные [fascinating] архитектурные белки эволюционировали, чтобы играть разнообразные роли в эпигенетических процессах

Литература