Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 12.7. Распределение белков trxG в хромосомах

^{Распределение белков trxG по всему геному изучали с помощью окрашивания политенных хромосом слюнных желез Drosophila антителами против BRM (а) или TRX (б). В соответствии с относительно глобальной ролью BRM в активации транскрипции он связан с сотнями сайтов паттерн которых существенно перекрывается с RNA pol II. Напротив, сильные сигналы TRX выявляются в значительно меньшем числе сайтов политенных хромосом}

Важный вопрос для будущих исследований касается роли, которую АТФ-зависимый ремоделинг играет в поддержании активированного состояния. Весьма интригует тот факт, что четыре члена trxG известны (BRM, KIS и OSA) или подозреваются (KIS) как члены больших АТФ-зависимых ремоделирующих хроматин комплексов, но ни один из других многочисленных АТФ-зависимых ремоделирующих комплексов не был идентифицирован в ходе генетических скринингов на trxG-белки Drosophila. Две преобладающих гипотезы (не являющиеся взаимоисключающими), предложенные для объяснения этого, заключаются в том, что ремоделирующие хроматин комплексы BRM и KIS «нацелены» на гены, важные для прогрессии развития, или что они обладают специальными характеристиками ремоделинга, которые являются уникально необходимыми для поддержания. Таким образом, возможно, что родовой [generic] АТФ-зависимый ремоделинг требуется для всех активных состояний и что для поддержания активного состояния важных для развития генов оказываются необходимыми эти члены trxG, поскольку они «нацелены» на эти гены. Возможно также, что поддержание требует специальных АТФ-зависимых функций, которые могут быть выполнены комплексами, содержащими члены trxG.

Заманчиво также думать о механизмах, которые могут использоваться ремоделерами для того, чтобы внести вклад в эпигенетическую регуляцию активного состояния. Можно представить себе три класса механизмов, к которым это могло бы относиться. Во-первых, функция ремоделинга могла бы потребоваться в каком-то косвенном режиме для облегчения связывания (или повторного связывания после репликации) генспецифичных активирующих белков, которые нужны для поддержания активной транскрипции. В этом случае ремоделеры не были бы «мозгами» эпигенетического механизма, но, вместо этого, действовали бы как инструмент, необходимый для эффективного функционирования требуемых белков. Во-вторых, ремоделеры могли бы работать одни или с гистоновыми шаперонами для вытеснения нуклеосом из данного района, и эта незанятость нуклеосомами гипотетически заставляла бы этот район оставаться ненуклеосомным после репликации. Как упоминалось выше, способность машины репликации/смещения нуклеосом точно рекапитулировать модификации или локализацию нуклеосом является важным вопросом эпигенетики, на который пока нет ответа. Наконец, механизмы ремоделинга могли бы повторно позиционировать нуклеосомы и создавать структуру, поддающуюся активации. Этот последний механизм получил экспериментальную поддержку в исследованиях гена альбумина (Chaya et al., 2001; Cirillo et al., 2002). Несколько связывающихся с ДНК факторов необходимы для поддержания активности этого ключевого гена в печени. Один из этих факторов, FoxA, связывается с сайтом на нуклеосоме, и эта специфическая конструкция «нуклеосома-FoxA» является ключевой для поддержания активного состояния гена альбумина. Хотя неясно, имеется ли необходимая роль для АТФ-зависимого ремоделинга, чтобы позиционировать эту специфическую нуклеосому в печени, этот пример показывает, что специфическое позиционирование нуклеосом обладает достаточным потенциалом, чтобы играть ключевую эпигенетическую роль [whether there is a required role for ATP-dependent remodeling to position this specific nucleosome in the liver, this example demonstrates the potential for specific nucleosome positioning to play a key epigenetic role].

2.2. Белки trxG, ковалентно модифицирующие нуклеосомные гистоны

Второй распространенный способ регулирования экспрессии генов включает ковалентную модификацию аминотерминальных «хвостов» коровых гистонов, составляющих белковый компонент нуклеосомы. Эти «хвосты», выступающие с поверхности нуклеосомы, могут опосредовать взаимодействия с другими нуклеосомами, а также с весьма разнообразными структурными и регуляторными белками. Ковалентная модификация гистоновых «хвостов» с помощью ацетилирования, метилирования или фосфорилирования может помогать «нацеливать» регуляторные комплексы на хроматин и может также непосредственно изменять способность нуклеосом компактизироваться в репрессивные структуры путем изменения заряда на этих «хвостах». Ковалентная модификация могла бы также обеспечивать метку, чтобы способствовать поддержанию специфического регулируемого состояния (поскольку ковалентно модифицированные гистоны обладают возможностью разделяться на две дочерние нити и тем самым воспроизводят информацию, содержащуюся в ковалентной метке) и передавать ее как материнской, так и дочерним клеткам после репликации. Остаются ли гистоны связанными с одной или с обеими дочерними нитями после репликации — это ключевой вопрос для потенциальных механизмов эпигенетического регулирования; вопрос этот остается спорным, по большей части в связи с поиском методов, которые позволили бы точно прослеживать индивидуальные гистоны в живых клетках.

Несколько белков trxG способны ковалентно модифицировать «хвосты» гистонов, и эти белки часто обнаруживаются в комплексах, способных осуществлять более чем один тип реакций модификации. Например, TRX Drosophila и его аналоги у других организмов метилируют гистон H3 по лизину 4 (H3K4): эта ковалентная метка прочно ассоциирована с активными генами у самых разных организмов, в том числе у дрожжей, мух и человека. Второй белок trxG, ASH1 (см. ниже), также обладает H3K4-метилтрансферазной активностью (Beisel et al., 2002; Byrd and Sheam, 2003). Подразумевалось, что H3K4-метилирование связано с поддержанием активной экспрессии генов у дрожжей, исходя из времени его появления и исчезновения на активных генах (Santos-Rosa et al., 2002; Pokholok et al., 2005). Тот факт, что члены trxG обладают этой модификационной (в отношении гистонов) активностью, еще больше связывает метку H3K4 с поддержанием активного состояния.

У дрожжей и у человека аналоги TRX обнаруживаются в комплексе, который содержит также третий белок группы trxG, Ash2, по последовательности не родственный Ash1 Дрожжевой гомолог trithorax, Setl, обнаруживается в комплексе (COMPASS или Set 1C), который имеет величину приблизительно 400 кДа и содержит пять других белков кроме Setl и Ash2 (Miller et al., 2001; Roguev et al., 2001). Единственной известной биохимической активностью этого комплекса является метилирование H3K4; пока еще не ясно, какова могла бы быть функция каждого из других белков, хотя один компонент мог бы способствовать воспроизведению метальной метки (см. ниже).

У человека имеются три гомолога TRX, называемые MLL1, MLL2 и hSETl. Белок MLL1 привлек наибольшее внимание в биохимических анализах и обнаруживается в большом комплексе (>10 членов), который содержит также человеческий гомолог ASH2 (Hughes et al., 2004; Yokoyama et al., 2004). Этот комплекс и дрожжевой комплекс оба содержат повторяющийся белок [repeat protein] WD40, который у человека называется WDR5 (Dou et al., 2005; Wysocka et al., 2005). Недавно было показано, что белок WDR5 может связываться с гистоном H3, который был метилирован по лизину 4 (Wysocka et al., 2005). Таким образом, связывание этого белка с меткой, созданной комплексом MLL1, в котором он находится, могло бы дать механизм для облегчения распространения этой метки. Это сходно с предположениями, сделанными относительно репрессивных комплексов, метилирующих H3K9, которые содержат НР1, белок, специфически связывающийся с метилированным К9 (дополнительные детали см. в главах 5 и 6).

Имеются данные, полученные как на Drosophila, так и на человеке, о том, что комплекс, содержащий TRX/ MLL, участвует также в ацетилировании. У человека MLL ассоциирован с ацетилтрансферазой MOF, которая ацетилирует лизин 16 гистона Н4, что является еще одной модификацией, связанной в норме с активацией (Dou et al., 2005). У мух TRX ассоциирован с dCBR — ацетилтрансферазой с широкой специфичностью, которая участвует в активации (Petruk et al., 2001). Ацетилирование могло бы работать совместно [synergistically] с метилированием H3K9, направляя активное состояние после функционирования этих комплексов trxG. Известно также, что ацетилирование предотвращает метилирование таких остатков, как H3K9 и H3K27, которые направляют репрессию матрицы.

Белок ASH1, еще один член trxG, тоже является метилтрансферазой гистонов, которая метилирует H3K4 (Beisel et al., 2002; Byrd and Sheam, 2003). Состав ни у одного комплекса, содержащего ASH1, не был установлен; непонятно также, как координируются активности ASH1 и комплексов, содержащих TRX/MLL1/SET1. Однако наблюдали также, что ASH1 колокализуется и ассоциируется с семейством ацетилтрансфераз СВР (Bantignies et al., 2000), что опять-таки предполагает, что метилирование и апетилирование идут рука об руку.

Существуют захватывающие, но все еще остающиеся без ответа вопросы относительно того, каким образом ковалентная модификация гистонов могла бы вносить вклад в функцию trxG. Какую функциональную роль играют метки? Ковалентная модификация может вносить свой вклад в эпигенетическое регулирование с помощью широкого спектра механизмов. Метки метилирования и ацетилирования могли служить для непосредственного изменения компактизации хроматина (иногда это обозначается как cis-эффекты, как на рис. 3.8). На способность хроматина входить в компактизированное состояние, которое, как обычно принимается, является репрессивным для транскрипции, влияет распределение зарядов на гистоновых «хвостах». Модификации, происходящие на лизине (например, ацетилирование), могут устранять положительный заряд, в норме обнаруживаемый с этим остатком, и, следовательно, могут прямо снижать способность нуклеосом формировать компактные структуры, повышая таким образом способность матрицы к транскрипции.

Предположили, что ковалентные метки создают сайты прочного связывания для комплексов, управляющих [direct] транскрипционной активацией. Эти ковалентные модификации способны создавать специфические «выросты» [«knobs»] на поверхности нуклеосом, которые соответсвуют «карманам» на комплексах, стимулирующих активацию, увеличивая таким образом энергию связывания и функцию этих комплексов. Например, ацетилирование гистоновых «хвостов» увеличивает связывание гомологами белка BRM, стимулируя таким образом АТФ-зависимый ремоделинг ацетилированных матриц (Hassan et al., 2001). Механизм этого типа, часто обозначаемый как «гистоновый код» или trans-эффекты ковалентных модификаций гистонов, потенциально может быть центральной эпигенетической функцией. Нужны дальнейшие исследования, чтобы определить, какие именно метки, созданные белками trxG, усиливают связывание каких именно комплексов, определить степень, с какой энергия связывания с одним модифицированным остатком может влиять на функцию и «нацеливание», и определить временной порядок добавления этих меток и возможность их поддержания при митозе.

Оборотная сторона этого механизма заключается в том, что эти метки могли бы подавлять связывание репрессивными комплексами. Ковалентная метка на ключевом остатке, необходимом для оптимального связывания каким-то репрессивным комплексом, могла бы сильно ингибировать связывание этим репрессивным комплексом. Например, известно, что связывание репрессивными комплексами увеличивается метилированием гистона H3 по К9 и К27 (Khorasanizadeh, 2004). Ацетилирование этих остатков и блокировало бы метилирование, и создавало бы «вырост» неправильной формы на гистоне, ослабляющий связывание этим репрессивным комплексом. Таким образом, способность модификаций влиять на функцию других комплексов может работать в обоих направлениях [cut in both directions], увеличивая действенность этого потенциального способа эпигенетической регуляции.

Эти механизмы не только не являются взаимоисключающими, но вероятно работают совместно, помогая поддерживать активное состояние. Метки, которые химически увеличивают возможность формировать компактное состояние (cis-эффект), могли бы также увеличивать способность комплексов связываться (trans-эффект) и еще более [further] стимулировать компактное состояние. Наоборот, метки которые химически уменьшают компактизацию, могли бы увеличивать связывание комплексов, которые также декомпактизируют нуклеосомы. Это механистически экономное использование ковалентных меток для изменения нескольких характеристик структуры хроматина и способности регуляторных комплексов связываться могло бы создавать мощные средства поддержания активного состояния.

3. Связи между белками trxG и общей транскрипционной машинерией

Тема частого обнаружения белков trxG в одном и том же комплексе продолжается белками skuld (skd) и kohtalo (kto). Эти два белка являются гомологами белков, биохимически идентифицированных как TRAP240 (Skuld) и TRAP230 (Kohtalo), которые оба являются членами комплекса «Mediator» (Janody et al., 2003). Этот медиаторный комплекс является крупным комплексом, функционирующим на поверхности раздела между ген-специфичными активаторными белками и образованием преинициационного комплекса, содержащего PH К-полимеразу II (Lewis and Reinberg, 2003). Таким образом, эти белки участвуют в общих активационных процессах, во многом таким же образом, каким в общей активации участвуют ремоделеры семейства SWI/SNF. SKD и КТО могли бы иметь некоторую специальную функцию, связанную с поддержанием, поскольку другие компоненты этого медиаторного комплекса не были идентифицированы при скрининге на гены trxG. Наблюдение, согласно которому SKD и КТО взаимодействуют друг с другом и согласно которому двойные мутанты skd kto имеют такой же фенотип, что и одиночные мутанты, привело к гипотезе о том, что эти два белка вместе образуют функциональный модуль, который каким-то образом изменяет действие медиатора (Janody et al., 2003).

4. Биохимические функции других белков trxG

Биохимические активности большинства других белков trxG остаются довольно таинственными. Ring3, человеческий аналог гена female-sterile homeotic (fsh) из группы trxG у Drosophila, кодирует ядерную протеинкиназу с двумя бромодоменами, для которой предполагается участие в продвижении по клеточному циклу и в лейкемогенезе, но субстраты которой в настоящее время неизвестны (Denis and Green, 1996). Ген Tonalli (Тпа) из группы trxG кодирует белок, родственный белкам SPRING finger, участвующим в сумоилировании, что позволяет предполагать, что он может также регулировать транскрипцию через ковалентную модификацию других, все еще неидентифицированных, белков (Gutierrez et al., 2003). Ген sallimus (sis) из группы trxG был идентифицирован при скрининге на экстрагенные супрессоры Рс (Kennison and Tamkun, 1988) и впоследствии оказался кодирующим Titin у Drosophila (Machado and Andrew, 2000). Подобно своему аналогу у позвоночных, Titin у Drosophila помогает поддерживать целостность и эластичность саркомера. Кроме того, Titin является хромосомным белком, необходимым для конденсации и расхождения хромосом (Machado and Andrew, 2000). Эти интригующие открытия позволяют предположить потенциальную роль белков trxG в регулировании структуры хроматина более высокого порядка.

5. Функциональные взаимодействия между белками trxG

Теперь, когда идентифицированы основные биохимические активности многих членов trxG и PcG, внимание переключилось на способ, каким эти активности скоординированы для регулирования транскрипции и поддержания активного состояния. Несмотря на отсутствие систем in vitro для изучения поддержания детеминированного состояния, в этом направлении был достигнут значительный прогресс. Одна популярная гипотеза заключается в том, что члены trxG и Peg облегчают последовательность зависимых событий, необходимых для поддержания активного или репрессированного состояния. Поддержка этой идеи пришла из недавних исследований PcG-комплексов PRC1 и PRC2; субъединица метилазы гистонов E(z) из комплекса PRC2, метилируя H3K27, создает ковалентную метку, которая непосредственно распознается хромодоменом субъединицы Рс комплекса PRC1 (Jacobs and Khorasanizadeh, 2002; Min et al., 2003). Таким образом, оказывается, что один комплекс PcG прямо стимулирует связывание другого комплекса PcG с хроматином

По аналогии возможно, что ковалентная модификация нуклеосом членами trxG, обладающими активностями метилтрансферазы или ацетилтрансферазы гистонов (например, TRX или ASH1), непосредственно регулирует «нацеливание» или активности членов trxG, участвующих в АТФ-зависимом ремоделинге хроматина (например, BRM [SWI/SNF], или KIS) (рис. 12.8). С этой возможностью согласуется тот факт, что BRM и другие субъединицы комплексов SWI/SNF содержат бромодомены, которые могут непосредственно взаимодействовать с ацетилированными «хвостами» гистонов, a KIS содержит два хромодомена, которые могут прямо взаимодействовать с метилированными «хвостами» гистонов. Эта модель, в пользу которой свидетельствуют недавние исследования факторов ремоделинга хроматина как у дрожжей, так и у млекопитающих (Agalioti et al., 2000; Hassan et al., 2001), является особенно привлекательной, потому что она обеспечивает механизм, посредством которого наследуемая модификация гистонов могла бы воспроизводить конститутивно «открытую» конфигурацию хроматина, пермиссивную для активной транскрипции.

6. Белки trxG: активаторы или антирепрессоры?

Еще одна важная проблема касается функциональных отношений между репрессорами PcG и активаторами trxG. Играют ли эти регуляторные белки независимые роли в активации и репрессии или же они функционируют в прямом противодействии, чтобы поддерживать наследуемое состояние? Недавние генетические исследования показывают, что удаление комплексов PcG обычно реактивирует гены даже в отсутствие TRX и ASH1 (Klymenko and Muller, 2004), что позволяет предположить, что белки trxG с активностью метилтрансферазы гистонов могут функционировать как антирепрессоры PcG в противоположность активаторам (рис. 12.8).

И биохимические, и генетические анализы доказывают, что могут существовать прямые связи между функцией trxG и функцией PcG. Одно интересное свойство белков PcG заключается в том, что они способны репрессировать транскрипцию, когда оказываются вблизи практически любого гена, транскрибируемого PH К-полимеразой И. Члены trxG, играющие глобальную роль в транскрипции, — в том числе BRM, KIS и другие члены trxG, участвующие в ремоделинге хроматина, — оказываются таким образом превосходными кандидатами на роль прямых мишеней репрессоров PcG (рис. 12.8). Один из главных комплексов PcG, комплекс PRC1, блокирует функцию комплексов ремоделинга из семейства SWI/SNF, очевидно путем блокирования доступа этого комплекса к матрице (Francis et al., 2001). Это согласуется с представлением о том, что один механизм репрессии PcG мог бы заключаться в том, чтобы предотвращать АТФ-зависимый ремоделинг членами trxG. Комплекс Brahma и PRC1 связывает, сверх того, тот факт, что оба они непосредственно взаимодействуют с белком Zeste — белком, играющим сложную роль в регулировании экспрессии генов у Drosophila, который мог бы способствовать прямым «переговорам» между этими двумя комплексами.

Вторым белком, связывающим белки PcG и белки trxG, является фактор GAGA, который кодируется геном Trithorax-like и который, таким образом, является членом trxG (Farkas et al., 1994). Этот белок может функционировать в некоторых промоторах как сиквенс-специфичный активаторный белок, но и является также заметным членом группы белков, которые связываются с репрессивным элементом Polycomb (PRE — Polycomb Repressive Element; глава 8). Нуклеотидные последовательности PRE управляют функцией PcG, и по крайней мере один PRE может действовать как модуль памяти, будучи присоединен к репортерному конструкту, что подчеркивает важность этих последовательностей. Нуклеотидные последовательности, связывающиеся с фактором GAGA, играют важную роль в функционировании PRE, и предполагается, что привязка белка GAGA к ДНК усиливает связывание и функционирование PRC1 (Mahmoudi and Verrijzer, 2001). Таким образом, фактор GAGA мог бы играть ключевые роли в поддержании активации (через его активирующие транскрипцию свойства) и в поддержании репрессии (через взаимодействия с белками PcG). Важная проблема для будущих исследований — понять, почему такие белки, как GAGA и Zeste оказываются взаимодействующими как с активирующей, так и с репрессирующей машинами, обеспечивающими поддержание состояния.

7. Выводы и перспективы

Две из основных проблем, касающихся функции белков trxG, остаются в значительной мере в области догадок. Во-первых, почему относительно небольшая подгруппа белков, необходимых для транскрипционной активации, генетически оцениваются как важные для поддержания активного состояния? Не происходит ли это потому, что эти белки играют глобальную роль в транскрипции, но экспрессируются в лимитирующих количествах, или случайно, благодаря счастливой способности эволюции к открытиям, стали особенно важными для генов, играющих важную роль в развитии? Во-вторых, каким образом активное состояние может поддерживаться при репликации и митозе? Репликация создает две дочерние нити, которые обе должны регулироваться идентично, а митоз требует конденсации и, тем самым, подавления транскрипции большинства генов в клетке. Какие механизмы создают эпигенетическую метку (метки), обеспечивающую реактивацию гена на обеих дочерних нитях после митоза?

Большинство белков trxG являются частью комплексов, широко используемых в экспрессии генов, и большинство этих комплексов содержат также многие другие белки, не входящие в trxG (табл. 12.1). Это ставит важный вопрос о том, существуют ли специальные функции, используемые для поддержания активной экспрессии генов. Возможно, что ремоделеры SWI/ SNF способны выполнять специальную функцию ремоделинга. что метилирование H3K4 «нацеливает» специальные комплексы и (или) конформации хроматина и что Skuld/Kohtalo изменяют функционирование Mediator каким-то специфическим образом, важным для поддержания. Как альтернатива, возможно, что каждый из этих белков осуществляет реакцию, в норме используемую для активации генов всех типов, и что эти комплексы находятся среди тех, которые возникли как существенные для поддержания по относительно неинтересной причине (например, потому, что даже сравнительно слабые изменения в экспрессии генов НОХ у Drosophila вызывают гомеотические трансформации) Для решения этих проблем нужно значительно больше сведений о точных механизмах, используемых каждым из этих белков в активации. Например, используют ли комплексы SWI/SNF энергию гидролиза АТФ таким же образом, как другие АТФ-зависимые комплексы, или же они отличаются каким-то важным образом в том, как эта энергия используется для изменения структуры нуклеосом? Структурные методы, включающие кристаллографию, биофизические методы, такие как анализ одиночных молекул [single-molecule analysis] и метод FRET (fluorescence resonance energy transfer) и получение детальных изображений in vivo, могли бы помочь пролить свет на то, существуют ли механизмы, специально предназначенные для эпигенетического поддержания активации. Начальные функциональные исследования, проведенные с комплексами trxG на простых модельных матрицах, являются всего лишь началом процесса поисков ответов на эти важные вопросы.