Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Генетические эксперименты на разных эукариотах подтвердили существенное значение CenH3 для формирования кинетохора и для расхождения хромосом (Amor et al., 2004а). Поскольку CenH3-содержащие нуклеосомы остаются на месте на протяжении всего клеточного цикла, они образуют фундамент для сборки других кинетохорных белков во время митоза и мейоза (глава 6). Чрезвычайно важным вопросом в исследованиях хромосом является вопрос о том, каким именно образом эти белки взаимодействуют, с тем чтобы обеспечить сцепление между центромерой и микротрубочками веретена, которое может противостоять сильным тянущим силам, прилагаемым к кинетохорам в анафазе. У дрожжей были идентифицированы несколько десятков специфичных для кинетохора белков (дополнительные детали см. в главе 6), хотя то, каким образом они взаимодействуют с содержащими CenH3 нуклеосомами и другими базовыми белками, такими как CENP-C, в настоящее время неизвестно. Еще одним вызовом является расшифровка процесса сборки CenH3 в нуклеосомы Тот факт, что центромеры составляют такую маленькую долю всего хроматина, затруднило биохимические подходы к этой замечательной проблеме, но мы надеемся, что совершенствующиеся технологии приведут к лучшему пониманию структуры и динамики кинетохор.

Рис. 13.5. Центромерные варианты H3 у модельных эукариот

^{(Слева) Хромосома человека, окрашенная антителами против специфичного для центромеры варианта гистона H3, CENP-A (зеленый цвет), и анти-CENP-B (красный цвет), маркирующий ?-сателлитную ДНК (любезно предоставлено Peter Warburton). (В центре) У Drosophila melanogaster анти-CenH3-антитела (красный цвет) окрашивают центромеры в метафазных хромосомах и на протяжении всей интерфазы (любезно предоставлено SusoPlatero). (Справа) У Caenorhabditis elegans анти-CenH3-антитела (зеленый цвет) окрашивают расположенные «конец в конец» голоцентромеры профазных хромосом (красный цвет) (любезно предоставлено Landon Moore)}

Эволюция CenH3s не похожа на эволюцию гистонов любого другого класса. В то время как гистон H3 инвариантен по последовательности, что отражает действие чрезвычайно сильного очищающего отбора на каждый остаток, CenH3s эволюируют быстро, особенно в линиях растений и животных (Malik and Henikoff, 2003). Наиболее очевидным образом это демонстрируют аминотерминальные «хвосты», которые различаются по длине и последовательности до такой степени, что становится невозможным выравнивание CenH3s разных таксономических групп. Даже домен histone fold в CenH3 эволюирует на порядки быстрее, чем такой же домен H3. Какова же причина этого разительного эволюционного различия между H3, который функционирует в центромерах, и H3, который функционирует в других местах?

Быстро эволюирующие участки генов CenH3 Drosophila и Arabidopsis обнаруживают избыток нуклеотидных замен типа replacement nucleotide substitutions по сравнению с тем, что можно было бы ожидать исходя из скорости синонимических замен (Malik and Henikoff, 2003). Этот избыток — признак адаптивной эволюции. Адаптивная эволюция у растений и животных видна также по еще одному главному центромерному фундаментальному белку [major centromere foundation protein], CENP-C (Talbert et al., 2004). Хотя адаптивная эволюция хорошо документирована для генов, участвующих в генетических конфликтах (таких, как «гонка вооружений» между хозяином и паразитом), эти гены являются единственными известными существенными однокопийными генами, адаптивно эволюционирующими у любого организма. В случае CenH3 и CENP-C участки адаптивной эволюции соответствуют участкам связывания и «нацеливания» на ДНК Это позволяет предполагать, что главные связывающиеся с центромерой белки адаптируются к эволюирующей центромерной ДНК, давая, таким образом, центромерному хроматину возможность взаимодействовать с консервативной кинетохорной машинерией, связывающей центромеру с микротрубочками веретена. Было высказано предположение, что центромеры конкурируют в ходе женского мейоза за включение в ядро яйцеклетки, чтобы не быть утраченными в составе полярных телец (Talbert et al., 2004). Возникла бы «гонка вооружений», ведущая к экспансии центромер, вероятно путем неравного кроссинговера между сестринскими хроматидами. Подавление хозяином этого процесса мейотического драйва с помощью CenH3 и CENP-C приводило бы к избытку изменений типа замен в участках, взаимодействующих с ДНК. Организмы, для центромер которых нет возможности конкурировать, таких как почкующиеся дрожжи, не подвергались бы центромерному драйву, и это могло бы объяснить тот факт, что у них маленькие центромеры и их белки CenH3 и CENP-C находятся под действием сильного очищающего отбора

Таким образом, мы видим, что специальный район генома, центромера, отличается одним классом вариантов гистонов, последовательности которых обнаруживают остатки «гонки вооружений», которая могла привести к чрезвычайной сложности центромер. Процесс RI-сборки, в каждом клеточном цикле «нацеливающий» новые нуклеосомы, содержащие CenH3, на центромеры, остается неизвестным (Amor et al., 2004а). Центромерные нуклеосомы демонстрируют примечательное отсутствие специфичности по последовательности в том, что они не только могут надежно локализоваться на неоцентромерах, которые совершенно непохожи на нативные центромеры (рис. 13.4), но и в том, что дрожжевой гомолог Cse4 может функционально замещать CENP-A человека (Wieland et al., 2004) (ни один из них не является адаптивно эволюирующим;

Talbert et al., 2004). Удивительно, что наши центромеры оставались в тех же самых положениях десятки миллионов лет без каких-либо очевидных детерминантов в виде специфических последовательностей, участвующих в поддерживающем их процессе. В той мере, в какой шигенетика означает наследственность, не зависящую от нуклеотидных последовательностей ДНК, наследование центромер в масштабах геологического времени является наиболее крайней формой, какую только можно себе представить. Тем не менее, мы все еще ищем механизм, чтобы объяснить, каким образом они поддерживают себя на протяжении даже одного клеточного цикла (дальнейшее обсуждение этой темы см. в главе 14).

6. Замещение гистоновым вариантом H3.3 обнаруживается в активном хроматине

Полагают, что транскрипционно активный хроматин, подобно центромерам, поддерживается эпигенетически и, подобно центромерам, активный хроматин обогащен вариантом гистона H3, называемым H3.3 (Henikoff and Ahmad, 2005). H3.3 очень похож по последовательности на канонические формы H3, отличаясь лишь четырьмя аминокислотами. При таких маленьких различиях можно было бы предположить, что эти две формы взаимозаменяемы. Однако у Drosophila H3.3 откладывается путем либо RC-, либо RI-сборки, тогда как H3 откладывается толко в репликационных фокусах RC-способом. Это различие между двумя вариантами закодировано в самом белке, причем три из четырех различий между H3 и H3.3 явно участвуют в предотвращении откладки H3 по способу RI (в ?-спирали 2, рис. 13.2). Очистка растворимых комплексов сборки у человека подтвердила, что эти две формы участвуют в разных процессах сборки: Н3.1 выделялся совместно с CAF-1 для RC-сборки, а H3.3 выделялся вместе с другими компонентами, в том числе с HirA, и участвовал в RI-сборке.

Хотя различия по четырем аминокислотам могли бы показаться практически несущественными, но если учесть, что человек, мухи и двустворчатые моллюски обладают H3.3, имеющими в точности одинаковую последовательность. эти отличия от H3 становятся заметными. Филогенетический анализ показывает, что пара H3/H3.3 возникала в разное время в ходе эволюции эукариот по меньшей мере четыре раза: у растений, у животных/грибов, у инфузорий и у Apicomplexa (Malik and Henikoff, 2003). Несмотря на отдельное происхождение от животных и грибов, пара H3/H3.3 животных и пара от растений (называемая Н3.1 [RC] и Н3.2 [RI] — во избежание путаницы мы обозначаем все изоформы RC как H3. а все изоформы RI как H3.3) поразительно похожи друг на друга. Один и тот же кластер аминокислот (позиции 87—90, который препятствует отложению H3 по RI-типу у Drosophila, оказался отличающимся у растений, и другое различие у животных (в позиции 31 находится Аа у H3 и либо Ser, либо Thr у H3.3) также обнаруживается у растений. Грибы особенно интересны. Исходно [ancestrally] они имеют и H3, и H3.3; однако аскомицеты, к которым относятся дрожжи и плесневые грибы, утратили форму H3. Таким образом, облигатная RC-форма гистона H3, привлекшая наибольшее внимание у животных, даже не присутствует у дрожжей.

Исследования H3.3 в основной массе хроматина показали, что активные фракции обогащены им (Henikoff and Ahmad, 2005). Однако разнообразные факторы вносили свой вклад в ситуацию неопределенности с этой потенциальной «меткой» активного хроматина во времена великого возбуждения в хроматиновой области, когда осознали, что модификации гистонов могут отличать активный хроматин от «молчащего». Прежде всего, отсутствовали какие-либо антитела, которые могли бы эффективно отличать H3 от H3.3 в хроматине (позиции 87—90 блокированы спиралями ДНК в нуклеосоме), тогда как превосходные антитела против многих посттрансляционных модификаций были легко доступными. Кроме того, различия по последовательности между H3 и H3.3, казавшиеся незначительными, не предполагали каких-либо фундаментальных различий в хроматине, тогда как модификации гистонов были главным образом по лизинам «хвостов», о которых было известно, что они влияют на взаимодействия хроматина или связывают ассоциированные с хроматином белки. Ощущение, что эти две формы гистона 3 должны быть взаимозаменяемыми, получило подтверждение в открытой у Tetrahyтепа возможности замены S-фазной формой гистона ее замещающего аналога. Наконец, влиятельная гипотеза «гистонового кода» представляла нуклеосомы как фиксированные мишени модификационных ферментов во время дифференцировки хроматина (Jenuwein and Allis, 2001). Однако становилось все более и более очевидным, что хроматин является высокодинамичным, и даже ассоциированные с гетерохроматином белки связываются с местами своего нахождения на минуты или даже менее (Phair et al., 2004). Оказывается, хроматин активно транскрибируемых генов находится в состоянии постоянного изменения, характеризующемся непрерывным замещением гистонов (Henikoff and Ahmad, 2005). Три коровых различия, отличающие H3 от H3.3, делают димеры H3.3•Н4 субстратом для RI-сборки, и сама по себе RI-сборка глубоко изменяет хроматин. В результате этого процесса активно транскрибируемые участки становятся маркированными H3.3 (рис. 13.6), и доказательства в пользу этого процесса следуют из наблюдения RI-замещения H3, метилированного по лизину 9 (H3K9me) меченым H3.3 [with tagged H3.3] в транскрибируемых PH К-полимеразами I и II (pol I и II) локусах (Schwartz and Ahmad, 2005).

Результатом динамичной природы хроматина в активных локусах является стирание предсуществовавших модификаций гистонов. Этим обеспечивается потенциальное решение вопроса о том, каким образом «молчащий» хроматин может становиться активированным, когда он гиперметилирован по H3K9 и H3K27 (модификации гистонов, обычно ассоциированные с репрессивным хроматином). Исследования временной динамики показали, что метилы на гистонах столь же стабильны, как и сами гистоны (Waterborg, 1993), хотя недавнее открытие деметил азы, специфичной для моно- и диметилированного H3K4 (Shi et al., 2004), показывает, что некоторые метальные группы могут энзиматически удаляться с гистонов. В целом, паттерны ковалентных модификаций гистонов могли бы быть результатом модификаций, уже присутствующих на гистонах в то время, когда они откладываются. Таким путем модифицирующие ферменты шли бы по уже проложенному следу вместе с машиной сборки, возможно облегчая этот процесс (Henikoff and Ahmad, 2005).

Рис. 13.6. H3.3 предпочтительно локализуется в активно транскрибируемых участках политенных хромосом Drosophila

^{Окрашивание DAPI (красный цвет) показывает паттерн бэндинга ДНК (слева), и H3.3-GFR (зеленый цвет) локализуется в междисковых промежутках (средняя часть), которые являются сайтами локализации РНК-полимеразы II. Правая часть рисунка — совмещение (перепечатано из: Schwartz and Ahmad, 2005)}

Эта модель динамической сборки предсказывает, что модификациями гистонов, которыми обогащен активный хроматин, должен быть обогащен и H3.3, и большинство измерений модификаций в H3 и H3.3 показали, что так оно и есть и у растений, и у животных. Более того, на основании этой модели ожидается, что активные модификации лизинов, такие как ацетилирование H3 и Н4 и метилирование H3K4 и H3K79, будут сильно коррелировать друг с другом, как наблюдалось в разных системах (O’Neill et al., 2003: Kurdistani et al., 2004; Schubeler et al., 2004). Наконец, динамическая RI-сборка в активных генах может объяснить, почему мутации CAF-1 вызывают утрату сайленсинга (Loyola and Almouzni, 2004): считается, что лишь около 10 % генома дрожжей находится в «молчащем» состоянии, и это, возможно, единственный хроматин, который не замещается динамически в геноме дрожжей. В отсутствие опосредуемой CAF-1 RC-сборки RI-сборка происходила бы по всему геному дрожжей, активируя прежде «молчащие» районы. Возможно, существование варианта H3, предназначенного для RC-сборки у многоклеточных эукариот, является адаптацией для удержания подавляющей части хроматина клетки в эпигенетически «молчащем» состоянии

Замещение дифференциально модифицированными димерами H3.3•Н4 позволяет предложить простую модель наследования активного хроматина у делящихся клеток (Henikoff and Ahmad, 2005). Активный хроматин оставался бы активным после разбавления обычными нуклеосомами после RC-сборки, если эта случайная смесь RI-отложенных и RC-отложенных нуклеосом не мешает таким активным процессам, как транскрипционная инициация и элонгация. Продолжение транскрипционной активности в результате восстанавливало бы хроматин в следующем клеточном цикле, приводя к постоянному поддержанию активного хроматина на протяжении всего развития. Возможность того, что вариант гистона постоянно поддерживается процессом RI-сборки, может относиться и к CenH3s, которые вставлялись бы в бреши, создаваемые «развертыванием» обычных нуклеосом в результате анафазного натяжения.

Когда клетки выходят из клеточного цикла и дифференцируются, они больше не продуцируют и не включают S-фазные гистоны, и в результате накапливается H3.3. Например, H3.3 накапливается в мозге крыс до уровня, составляющего 87 % от уровня гистона H3, ко времени достижения крысами 400-дневного возраста (Henikoff and Ahmad, 2005). Имеет ли это градуальное замещение хроматина какое-нибудь функциональное значение или не имеет — неизвестно. Неизвестно также, является ли активный процесс, делающий возможным замещение, тем же самым, что и процесс, наблюдаемый в транскрипционно активных локусах Одна из возможностей заключается в том, что разрушение хроматина проходящей РНК-полимеразой или машиной ремоделинга хроматина вызывает локальное развертывание нуклеосомы и случайную утрату димера H3.3•Н4 (рис. 13.7). Это сопровождалось бы воссозданием [reassembly] нуклеосомы вслед за полимеразой с замещением утраченного димера димером H3.3•Н4 с помощью комплекса HirA. Лишь тогда, когда полимеразы упакованы слишком плотно для осуществления сборки, нуклеосомы полностью развертываются [unravel].

7. Фосфорилирование Н2АХ функционирует в репарации двунитевых разрывов ДНК

Гистоны Н2А также образуют семейство разных вариантов, обнаруживаемых у всех эукариот. Вариант Н2АХ определяется по присутствию мотива карбокситерминальной аминокислотной последовательности, SQ(E или D)?, где ? означает гидрофобную аминокислоту. Серии в этой последовательности-мотиве является сайтом фосфорилирования, продуцируя модифицированный белок, обозначаемый «?-Н2АХ». Динамическая природа хроматина и фосфорилирование Н2АХ особенно очевидны, когда в ДНК возникают двунитевые (ds, double-stranded) разрывы (Morrison and Shen, 2005). Летальность даже одиночного двунитевого разрыва требует немедленных действий по репарации повреждения и восстановления непрерывности двойной спирали. Обнаружение ds-разрыва в норме происходит в пределах минуты или около того с момента его образования, и это, в свою очередь, включает быстрое фосфорилирование Н2АХ в непосредственной близости от сайта разрыва. Это фосфорилирование выполняется членами семейства фосфоинозитол 3-киназоподобных киназ. Вслед за этим первоначальным событием фосфорилирование Н2АХ быстро распространяется вдоль по хромосоме, маркируя относительно большой хроматиновый домен, окружающий этот разрыв. Наконец, этот ds-разрыв в конце концов репарируется либо путем гомологичной рекомбинации, либо негомологичным воссоединением концов [nonhomologous end-joining], и метка-фосфорилирование удаляется.

Рис. 13.7. Модель независимого от репликации замещения или обмена

^{Большая молекулярная машина (либо комплекс SWR1, либо РНК-полимераза II) частично или полностью расвертывает нуклеосому во время своего прохождения. Результатом этого оказывается либо сохранение гетеродимерных субъединиц, как, например, облегчаемый FACT перенос Н2А•Н2В из положения перед РНК-полимеразой в положение позади нее (Formosa et al. 2002; Belotserkovskaya et al. 2003), либо утрата гетеродимера. В последнем случае процесс репарации хроматина заменяет утраченный гетеродимер либо H2AZ•Н2В (верхняя часть рисунка), либо Н3.3•Н4 (нижняя часть рисунка)}

Фосфорилирование Н2АХ не является существенным для обнаружения или репарации ds-разрывов, потому что делеция гена или мутация «мишени» — серинового остатка не отменяет репарацию. Однако Н2АХ не просто маркер повреждения, поскольку такие мутанты уменьшили эффективность репарации и являются гиперчувствительными к радиационному повреждению и генотоксическим агентам. В настоящее время полагают, что Н2АХ функционирует в процессе репарации ds-разрывов по крайней мере двумя способами. Во-первых, он может помогать рекрутировать или сохранять белки, требующиеся для репарации в сайте разрыва (Morrison and Shen, 2005). Во-вторых, он может стабилизировать хромосому, окружая разорванные концы, путем рекрутирования когезина, белкового комплекса, ответственного за удерживание вместе сестринских хроматид (Lowndes and Toh, 2005).

Эволюция Н2АХ не похожа на эволюцию других вариантов гистонов. Хотя ген Н2АХ обнаружен почти у всех эукариот, он возникал неоднократно в относительно недавнее время (Malik and Henikoff, 2003). Например, версия Н2АХ, обнаруженная у Drosophila, отличается от версии, обнаруживаемой у другого двукрылого насекомого, Anopheles Предположительно, способность развивать новый Н2АХ из канонической формы Н2А является следствием простого мотива SQ(E или D)©. Ожидается, что развитие такого мотива на карбоксильном конце канонического Н2А происходило неоднократно в ходе эволюции. Случайная утрата существующего Н2АХ с вновь отчеканенной версией могла бы подпитываться необходимостью для Н2АХ быть очень однородно распределенным, потому что ds-разрывы могут происходить в любом месте генома. Если в существующем гене Н2АХ происходят мутации, уменьшающие его сходство с каноническим Н2А таким образом, что его сборка становится менее эффективной или однородной, возникнет сильное давление отбора, чтобы заместить его версией, которая более похожа на канонический Н2А. Эта логика могла бы помочь объяснить исключительный случай Н2Ах Drosophila, который, в отличие от других эукариот, происходит не от своего канонического Н2А, а, скорее, от удаленной линии H2AZ (описываемой ниже). Если все, что нужно, чтобы быть Н2АХ — это находиться в положении Н2А в нуклеосоме и иметь карбокситерминальный мотив для фосфорилирования, H2AZ может развить в себе эти способности.

Рис. 13.8. Стадия пахитены сперматогенеза, показывающая зависимость формирования полового тельца от Н2АХ

^{В нормальных сперматоцитах млекопитающих видно, что ядерная структура, называемая половым тельцем (стрелка, помечено зеленым цветом на правых рисунках), охватывает неспаренный бивалент XY (помечен на левых рисунках). Синаптонемный комплекс, выравнивающий спаренные хромосомы, окрашен в красный цвет. Половое тельце в норме обогащено Н2АХ (Н2АХ+/+). В сперматоцитах Н2АХ-/- половое тельце не образуется, и эпитоп полового тельца становится диспергированным по аутосомам (нижний правый рисунок). Масштабная линейка = 10 мкм. Фотографии любезно предоставлены Shantha Mahadevaiah и Paul Burgoyne (Fernandez-Capetillo et al., 2003)}

Репарация ds-разрывов представляет собой несомненно универсальную функцию фосфорилирования Н2АХ, и, казалось бы, у этого процесса нет никакого стабильного эпигенетического аспекта. Однако мыши с нуль-мутацией по Н2АХ стерильны, и цитологическое изучение сперматогенеза млекопитающих выявило яркую эпигенетическую особенность — специфическое фосфорилирование Н2АХ на биваленте XY (рис. 13.8) (Femandez-Capetillo et al., 2003). Эта хромосомная пара занимает отдельное «половое тельце» во время мейотической профазы, предположительно участвующее в сайленсинге сцепленных с полом генов во время мужского мейоза. Фосфорилирование Н2АХ играет существенную роль в формировании нормального полового тельца, и дефектные по Н2АХ сперматоциты не способны спариваться или конденсироваться и не могут инактивировать гены X и Y во время мейоза. Фосфорилирование Н2АХ бивалента XY отличается от процесса, происходящего в ds-разрывах. Фосфорилирование XY в половом тельце не требует разрывов; скорее, оно происходит наиболее заметным образом в неспаренных участках хромосом. Механизмы, посредством которых фосфорилирование Н2АХ «нацеливается» на неспаренные хромосомы, и то, как это событие приводит к конденсации, спариванию и сайленсингу, в настоящее время неизвестны. Однако интересно пофантазировать, что эта роль может иметь отношение к способности взаимодействовать с когезином и рекрутировать его.