Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

г С. elegans обладает примерно 20 доменными белками SET, но H3K9 HKMT не была еще идентифицирована у этого организма. д S. pombe содержит другой Rikl-подобный белок, Ddbl, который участвует в репарации повреждений ДНК, но неизвестно, участвует ли он и в формировании гетерохроматина.

RNAi, связывающиеся с транскриптом гена, могут индуцировать зависимый от хроматина сайленсинг генов в cis-положении, ясно демонстрирует, что этот процесс может стимулироваться посредством первоначальных взаимодействий с вновь синтезируемыми РНК-транскриптами (Buhler et al., 2006). Важно, что m-ограничение исключает возможность того, что начальные события синтеза dsRNA и образование siRNA происходят на зрелых транскриптах, где hRNA, полученные с разных аллелей, нельзя различить. Более того, модель РНК-РНК-взаимодействия прямо предсказывает, что для сборки гетерохроматина, опосредованной RNAi, должна быть необходимой транскрипция в локусе-мишени. Хотя эта потребность в транскрипции и не была непосредственно проверена, мутации в двух разных субъединицах РНК-полимеразы II (RNA pol II), обозначаемых Rpb2 и Rpb7, характеризуются специфическими дефектами в образовании siRNA и сборке гетерохроматина, но не в общей транскрипции (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005). Это заставляет вспомнить мутанты Rbpl, которые характеризовались дефектами в модификациях гистонов (т.е. метилировании H3K4 и убиквитинировании Н2В), сопряженными с элонгацией при транскрипции (Hampsey and Reinberg, 2003), и создает прецедент для предположения о том, что опосредованное RNAi метилирование по H3K9 и формирование гетерохроматина могли бы быть сопряжены с транскрипционной элонгацией через ассоциацию комплексов RNAi с РНК-полимеразой II. В действительности, в противоположность широко принятому мнению о том, что гетерохроматин является недоступной структурой, подавляющей транскрипцию, опосредованная RNAi сборка гетерохроматина очень мало влияет или вовсе не влияет на ассоциацию РНК-полимеразы II с центромерными повторами у S. pombe (Volpe et al., 2002; Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005; Buhler etal., 2006). Следовательно, вновь синтезируемые РНК-транскрипты, действующие как матрицы для RITS в модели РНК-РНК-распознавания, присутствуют в гетерохроматиновых доменах (рис. 8.4).

В пользу модели РНК-РНК-«нацеливания» говорит также наблюдение, что компоненты комплексов как RITS, так и RDRC могут быть локализованы в некодирующих центромерных РНК в экспериментах по поперечным сшивкам in vivo (Motamedi et al., 2004). Эта локализация зависит от siRNA, что позволяет предположить участие в ней взаимодействий с некодирующей РНК на основе спаривания оснований. Кроме того, она требует HKMT Clr4, что позволяет предполагать, что она сопряжена со связыванием RITS с метилированными H3K9 и происходит на хроматине. Тем не менее, нельзя исключить, что siRNAs могут также распознавать ДНК непосредственно, на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании оснований. Например, у растений siRNAs, комплементарные к промоторным районам, которые (предположительно) не транскрибируются, все еще могут направлять метилирование ДНК, которое является еще одной модификацией, происходящей в ходе формирования гетерохроматина в этих районах (глава 9).

7. Как RNAi рекрутирует энзимы, модифицирующие хроматин?

Рекрутирование Clr4 и Swi6 является ключевым этапом в инициации метилирования по H3K9 и сборки гетерохроматина в модели авторегуляторной модификации-связывания (рис. 8.3 и 8.4) (Grewal and Moazed, 2003). Однако, поскольку связь RITS с хроматином и катализируемое Clr4 метилирование гистонов по H3K9 являются взаимозависимыми процессами, оказалось трудным определить событие, обеспечивающее первоначальное переключение зависимой от RNAi сборкой гетрохроматина. Одно из решений этой проблемы «курицы и яйца» заключается в том, что первоначальный сигнал для сборки гетерохроматина мог бы быть обеспечен зависимыми от siRNA взаимодействиями на основе спаривания оснований (рис. 8.4). В соответствии с этой гипотезой генерация de novo ura4+ siRNAs стимулирует сайленсинг прежде активной копии гена ura4\ сопряженный с рекрутированием RITS и Swi6 к хроматину (Buhler et al., 2006). Исходное связывание RITS может, однако, быть преходящим и трудным для регистрации; стабильное связывание RITS с хроматином требовало бы двойных взаимодействий между (1) связанными с RITS siRNAs и вновь синтезируемым транскриптом и (2) связыванием хромодомена Chp1 с метилированными H3K9 В этой модели сам RITS непосредственно рекрутирует Clr4. Альтернативная возможность заключается в том, что Clr4 может рекрутироваться по параллельному пути с участием одного или нескольких белков, связывающихся с ДНК, как это имеет место в районе «молчащего» типа спаривания и в теломерных районах (Jia et al., 2004$ Kanoh et al., 2005). В любом сценарии опосредованное Clr4 метилирование H3K9 было бы необходимо для стабилизации связи RITS с хроматином, что затем ведет к рекрутированию RDRC, синтезу dsRNA и образованию siRNA (рис. 8.5).

Рис. 8.5. Модель котранскрипционного образования dsRNA и siRNA и рекрутирование комплекса Clr4-Rik1-Сиl4-метилтрансферазы гистонов у S. pombe

Недавно обнаружили, что Clr4 является компонентом мультипротеинового комплекса, который содержит белок Rikl гетерохроматина. Cullin E3-убиквитинлигазу и несколько других белков (Hong et al., 2005; Horn et al., 2005; Jia et al. 2005; Li et al., 2005). Далее эти ассоциированные с Clr4 белки усиливают связь между РНК и формированием гетерохроматина. Белок Rikl является членом большого семейства белков типа р propeller WD repeat, участие которых в связывании с РНК или ДНК предполагалось. Среди членов этого белкового семейства — фактор CPSF-A (Cleavage Polyadenylation Specificity Factor А), участвующий в сплайсинге пре-иРНК, и белок Ddbl (DN A damage binding 1), участвующий в связывании с поврежденной УФ ДНК. Особый интерес представляет CPSF-A, поскольку Rikl сходен по последовательности со своим предполагаемым связывающимся с РНК доменом, участвующим в распознавании последовательностей полиаденилирования иРНК (Barabino et al., 2000). Белок Ddbl, подобно белку Rikl, является компонентом комплекса Си14-Е3-убиквитинлигазы и участвует в распознавании и репарации ДНК, поврежденной УФ (Higa et al., 2003; Zhong et al., 2003). Весьма интригующая возможность заключается в том, что Rikl действует похожим на действие CPSF-A и Ddbl образом, связываясь во время сборки гетерохроматина с продуктом, произведенным RNAi (рис. 8.5).

8. Модификации хроматина и ДНК у Arabidopsis, опосредованные RNAi

Механизм, посредством которого RNAi направляет модификации гетерохроматина у растений, сходен с таковым у дробянковых дрожжей, хотя имеются и многочисленные отличия. Наиболее важное отличие заключается в том, что у растений метилированная ДНК имеется во многих репрессивных районах гетерохроматина: в этом отношении они напоминают позвоночных, но отличаются от червей и Drosophila (Lippman and Martienssen, 2004). Четыре цикла генетического скрининга, направленного на отбор мутантов с ослабленным TGS, опосредованным РНК, выявили мутантов по HKMTs, специфичным к H3K9, и по компонентам RNAi, но они также вскрыли необходимую функцию ДНК-метилтрансфераз, SWI/ SNF-комплексов ремоделинга и новую РНК-полимеразу (Baulcombe, 2004). Этот скрининг детально описан в главе 9, но здесь мы кратко сравним этот механизм у дробянковых дрожжей и у растений.

Для каждого скрининга на мутанты сайленсинга использовались инвертированные повторы, введенные в trans-конфигурации, чтобы индуцировать сайленсинг эндогенных или трансгенных репортерных генов. Ослабление сайленсинга указывает на мутацию, возникшую в некоем необходимом компоненте пути, ведущем к сайленсингу. Использованными при этом эндогенными генами были PAI2 (участвует в биосинтезе аминокислот) (Mathieu and Bender, 2004) и SUPERMAN (транскрипционный фактор, регулирующий развитие цветка) (Chan et al., 2004), и эти репортерные гены управлялись либо сильным вирусным промотором, либо сильным промотором, специфичным для семени (Matzke et al., 2004). В каждом случае промотор был мишенью для сайленсинга, в некоторых случаях вместе с остальной частью данного гена. Ряд генов, найденных в результате этих экспериментов по скринингу, проиллюстрирован на рис. 8.6 (см. также табл. 9.1). Был идентифицирован лишь один мутант по RNAi (в одном из циклов скрининга), и это был ген AG04 (аргонавт). Однако в трех циклах скрининга были обнаружены мутанты по ДНК-метилтрансферазам, в том числе МЕТ1 и СМЕТЗ. Третья ДНК-метилтрансфераза, родственная DNMT3 млекопитающих, была идентифицирована методом обратной генетики, поскольку эта активность кодируется DRM1 и DRM2, двумя избыточными генами, которые невозможно определить в ходе скрининга одиночных мутантов (глава 9). И в самом деле, избыточность может объяснить невозможность обнаружить дополнительне компоненты аппарата RNAi: например, хотя DCL3 (DICER-LIKE 3) и RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 (RDRP) преимущественно требуются для производства siRNA размером 24 нуклеотида, ассоциированной с транспозонами и повторами, по меньшей мере два других гена DCL у Arabidopsis могут в некоторой степени замещать DCL3 (Gasciolli et al., 2005).

Среди других мутантов, обнаруженных при скрининге РА 12, были мутанты по гену KYP/SUVH4 (гену H3K9-метилтрансферазы) и содержащему хромодомен гену СМТЗ (гену ДНК-метилтрансферазы). Параллели с дробянковыми дрожжами в этом случае поражают, поскольку комплекс RITS содержит как белок Argonaute, так и хромодоменный белок Chp1, который для своей ассоциации с хромосомой зависит от метилирования H3K9. Однако, в отличие от дробянковых дрожжей, у Arabidopsis утрата СМТЗ или H3K9me2 не приводит к потере siRNA (Lippman et al., 2003), и еще неясно, формируют ли эти белки комплекс с AG04. У Arabidopsis имеются, однако, несколько других HKMTs, специфичных к H3K9; по крайней мере три из них обладают генетической функцией, так что и здесь избыточность может частично объяснять ситуацию (Ebbs et al., 2005)

Рис. 8.6. Белки RNAi и хроматина, необходимые для метилирования ДНК и гистонов, опосредованного RNAi, у Arabidopsis

^{Синтез dsRNA с повторяющихся элементов ДНК обеспечивает субстрат для опосредованного Dicer расщепления и производства siRNA (DCL3 и другие белки типа Dicer). Направляемые РНК РНК-полимеразы (RdRp, RdR2) и РНК-полимераза IV (RNA Pol IV) могут непосредственно участвовать в синтезе dsRNA или ее амплификации. siRNAs затем грузятся на белки Argonaute (напр., AG04), что, вероятно, в ассоциации с другими факторами помогает «нацелить» похожие повторяющиеся последовательности для метилирования ДНК и H3K9}

Мутанты по другим ДНК-метил трансферазам, МЕТ1 и DRM1/2, в противоположность мутантам по СМТЗ, приводят к утрате накопления siRNA, по крайней мере, с некоей подгруппы транспозонов и с тандемных повторов, которые обычно продуцируют siRNA, если они транскрибируются (Martienssen, 2003). В этих случаях утрата siRNA скоррелирована с потерей H3K9me2 (Cao et al., 2003; Lippman et al., 2003). Мутанты по AT-Фазе DDM1 (decreased DNA methylation) SWI2/SNF2-ремоделинга хроматина также ликвидируют накопление siRNA и H3K9me2 с большой группы транспозонов, хотя в тех случаях, когда siRNA сохраняется, сохраняется и H3K9me2 (Lippman et al., 2003). Возможно поэтому, что siRNA у растений связана с хромосомой через метилированную ДНК вместо связывания (или в дополнение к связыванию) через метилированные гистоны. как это имеет место у S. pombe (рис. 8.7).

DDM1 обладает сильно выраженной специфичностью к транспозонам и повторам и должна как-то распознавать их как последовательности, отличные от генов. siRNA, возможно связанная с хромосомой с помощью метил-связывающих белков, могла бы обладать необходимой специфичностью для такого разграничения. В соответствии с этой идеей, транспозоны и повторы у Arabidopsis являются основным источником siRNA размером 24 нуклеотида и некоторых siRNA размером 21 нуклеотид (Lippman et al., 2004). Центромерные сателлитные повторы, расположенные в виде десятков тысяч тандемных копий по обе стороны каждой центромеры, также транскрибируются И процессируются RNAi (рис. 8.6). Этот процессинг зависит от DCL3, RDR2 и DDM1. Сайленсинг также зависит от H3K9me2 и СМТЗ. Однако сайленсинг здесь более сложный, чем у дробянковых дрожжей, поскольку ретротранспозонные вставки в эти повторы могут сайленсировать их, а это зависит от других механизмов с участием МЕТ1, DDM1 и деацетилазы гистонов HDA6 (May et al., 2005).

Как упоминалось выше, у дробянковых дрожжей субъединицы РНК-полимеразы II (RNA Pol II) необходимы для сайленсинга и производства siRNA, что говорит в пользу идеи, согласно которой аппарат RNAi и модификации хроматина рекрутируется к хромосомам с помощью вновь синтезируемых транскриптов (рис. 8.5). У Arabidopsis две субъединицы новой РНК-полимеразы (RNApol IV) были обнаружены в ходе одного из четырех выше упоминавшихся скринингов (Kanno et al., 2005), но сначала были изолированы как слабые мутанты по PTGS, наряду с мутантами по РНК-зависимой РНК-полимеразе (Herr et al., 2005). Пока еще не известно, какая матрица используется RNA pol IV, но предположили (Vaughn and Martienssen, 2005), что это могут быть и метилированная ДНК (Onodera et al., 2005), и двунитевая РНК. Только самые крупные субъединицы уникальны для RNA pol IV, которая, как предполагается, использует тот же набор малых субъединиц, что и RNA pol II Дополнительные SWI2/SNF2-peмoдeлepы хроматина, которые также были обнаружены в ходе этих опытов по скринингу, могут изменять локальную структуру хроматина и облегчать процессивность RNA pol IV (Kanno et al., 2004). Сходную роль можно предположить для DDM1, хотя потребность для DDM1 (которая также является ремоделером хроматина) в сайленсирующих гранспозонах гораздо более жесткая, чем у RNA pol IV или других белков SWI2/SNF2.

^{Рис. 8.7. Гипотетические модели относительно роли RNA pol IVв метилировании ДНК и (или) гистона H3, направляемом RNAi}

^{(a) RNA pol IV транскрибирует метилированную ДНК; КвК2 синтезирует dsRNA, используя продукт, производимый RNA pol IV. Затем siRNAs «направляют» метилтрансферазный комплекс к хромосоме. (б) RNA pol IV использует матрицу dsRNA, синтезированную RdR2, для производства большего количества матриц ssRNA}

Гены могут быть эпигенетически сайленсированы близлежащими транспозонами; важным примером этого

у Arabidopsis является импринтированный гомеобоксный ген FWA (Kinoshita et al., 2004). Первые два экзона этого гена являются некодирующими и образуют тандемный повтор благодаря древней вставке элемента SINE в этот сайт (Lippman et al., 2004). У мутантов по met1 (т.е. ДНК-метилтрансферазе) siRNAs, синтезированные с элемента SINE, утрачены, и этот ген в меристеме соцветия обнаруживает сильную ап-регуляцию, что приводит к позднему цветению. Такой фенотип не наблюдается у мутантов по RNAi, даже тогда, когда siRNA утрачены. Вместо этого RNAi может играть роль в инициации сайленсинга FWA, потому что трансгены FWA быстро сайленсируются, когда впервые вводятся в растение, и этот сайленсинг зависит от DCL3, RDR2 и AG04 (Chan et al., 2004). Сайленсинг мог бы затем поддерживаться метилированием ДНК, регулируемым МЕТ1. Подобным же образом аллели FWA, характеризующиеся поздним цветением, стабильно наследуются в бэккроссах после удаления с фона мутантов met1 или ddml, поскольку поддержание эпиаллелей является наследуемым (Soppe et al., 2000).

Наконец, возможно, что при некоторых обстоятельствах miRNA могут направлять метилирование ДНК генов. У Arabidopsis miRNA 165 и 166 делают иРНК с гена PHABULOSA мишенью для расщепления, и сам этот ген метилируется «вниз по течению» от участка, который соответствует miRNA по последовательности. Интересно, что это соответствие распространяется на место присоединения экзона, так что сплайсированная РНК должна взаимодействовать с miRNA, если она «направляет» метилирование (Bao et al., 2004). Однако другие члены того же семейства генов не метилируются таким образом, как и большинство других генов, являющихся «мишенями» для miRNA (Martienssen et al., 2004; Ronemus and Martienssen, 2005). Наоборот, метилируются несколько других генов в геноме Arabidopsis, обычно на их 3’-конце, с помощью механизма, для которого нужен МЕТ1, но не нужен DDM1 (Lippman et al., 2004; Tran et al., 2005). Остается посмотреть, участвует ли в этих случаях РНК.

9. Консерватизм модификаций хроматина, опосредованных RNAi, у животных

Возможно, наиболее всесторонне изученные примеры эпигенетического сайленсинга мы находим у животных, в том числе у Drosophila и С. elegans, а также у мыши. Роль РНК и РНК-интерференции в транскрипционном сайленсинге и модификациях гетерохроматина оказывается консервативной у некоторых модельных животных, как и у протистов и растений. У Drosophila и PIW1, и Aubergine (Sting), гомолог Argonaute класса PIWI, необходимы для эпигенетического и гетерохроматинового сайленсинга (глава 5). Ретротранспозоны Gypsy являются «мишенью» сайленсинга в клетках фолликулов яичника и женских гонадах со стороны самого PIWI (Sarot et al., 2004). Это опосредуется гетерохроматиновым геном Flamenco (со всё еще не известной функцией) и требует 5 UTR полипротеинового гена Gypsy Выявление малых РНК размером 25—27 нуклеотидов из этого района заставляет предполагать, что это происходит с помошыо механизма, опосредуемого RNAi. ДНК-транспозоны типа «cut-and-paste» также подвержены влиянию RNAi Например, некоторые теломерные P-элементы (один из типов ДНК-транспозонов) могут супрессировать перемещение в другое место в геноме, когда они унаследованы через женский зародышевый путь, давая в результате сильно репрессивный «цитотип». Эта репрессия полностью зависит от гомолога PIWI, Aubergine, а также от гомолога Swi6, НР1 (Reiss et al., 2004). Однако не все Р-репрессивные цитотипы — например, цитотипы, опосредуемые другими, не теломерными Р-элементами, — зависят от Aubergine или НР1.

У Drosophila несцепленные трансгены сайленсируются посттранскрипционно, если они присутствуют во многих копиях (Pal-Bhadra et al., 1997, 2002). Сайленсинг связан с большими количествами siRNa размером 21 нуклеотид и зависит от PIWI. Трансгенные слияния могут тоже сайленсировать друг друга транскрипционно, способом, требующим хроматиновый репрессор Polycomb. Этот сайленсинг не связан с повышенными уровнями siRNA из транскрипта трансгена, но (в основном) зависит от PIWI. Участие Polycomb в этом примере зависимого от PIWI сайленсинга и НР1 в других примерах указывает на путь RNAi и метилирование гистонов в процессе сайленсирования. У Drosophila тандемные порядки трансгенов также обнаруживают эффект положения мозаичного типа, и эта мозаичность сильно подавляется мутантами по HP 1, а также по piwi, aubergine и предполагаемой РНК-геликазе Spindle-Е (hornless) (Pal-Bhadra et al. 2004). Трансгены, вставленные в центрический гетерохроматин, также испытывают влияние, и в клетках, мутантных по Spindle-E, уровни H3K9me2 гетерохроматина снижены. Эти наблюдения убедительно свидетельствуют в пользу роли как белков хроматина, так и компонентов RNAi-пути в сайленсинге генов, находящихся в гетерохроматине Drosophila.

В мужском зародышевом пути Drosophila гетерохроматиновые повторы Supressor of Stellate (Su(ste)), локализующиеся на Y-хромосоме, транскрибируются во время развития сперматоцитов сначала на антисмысловой нити, а затем на обеих нитях, возможно, после вставки близлежащего транспозона (Aravin et al., 2001). Эти ядерные транскрипты требуются, чтобы сайленсировать смысловые транскрипты близкородственного гена Stellate. сцепленного с X, сверхэкспрессия которого приводит к дефектам в сперматогенезе. Хотя здесь участвуют гетерохроматиновые последовательности, сайленсинг в этом случае является, по-видимому, посттранскрипционным, связан с siRNA размером 25—27 нуклеотидов и зависит как от Aubergine, так и от Spindle-E.

У С. elegans были опубликованы примеры TGS в соматических клетках. Это зависит от генов RNAi-пути rde-1, dcr-1, rde-4 и rtf-1, а также от гомологов НР1 и аппарата модификации гистонов (Grishok et al.. 2005). Соматический гетерохроматин не очень широко распространен у С. elegans, но в зародышевом пути описан пример естественно происходящего зависимого от RNAi гетерохроматинового сайленсинга (Sijen and Plasterk, 2003). Во время мейоза неспаренные последовательности. такие как Х-хромосома у самцов, сайленсируются посредством H3K9me2, и этот сайленсинг зависит от РНК-зависимой РНК-полимеразы (Maine et al., 2005; глава 15), что напоминает о мейотическом сайленсинге неспаренной ДНК (MSUD) у Neurospora (см. Shiu et al., 2001; глава 6). Однако другие компоненты аппарата RNAi не связывали с этим процессом и неизвестно, связано ли это механистически [mechanistically] с опосредованной RNAi сборкой гетерохроматина у дробянковых дрожжей.

Наконец, как и у Drosophila, у клеток млекопитающих нет генов, родственных генам РНК-зависимых РНК-полимераз, найденных у растений, червей и грибов. Тем не менее, участие антисмысловой РНК предполагалось в большинстве лучше всего изученных эпигенетических явлений — импринтинге и инактивации Х-хромосомы (главы 19 и 17, соответственно). В случае инактивации Х-хромосомы сплайсированная и полиаденилированная некодирующая РНК размером 17 тыс. о., известная как Xist, необходима для сайленсирования неактивной Х-хромосомы, с которой она экспрессируется. Напротив, на активной Х-хромосоме сайленсирована сама Xist; этот процесс отчасти зависит от антисмысловой РНК Tsix. Сайленсинг сопровождается модификацией гистонов, ассоциированных с участками хроматина «вверх по течению», которые маркированы H3K9me2 и H3K27me3 (глава 17). Сайленсинг других импринтированных локусов у мышей, в том числе Igf2r и района Dlk1-Gtl2, также поддерживается антисмысловыми транскриптами с отцовской или материнской аллели, соответственно. В случае Dlk1-Gtl2 эта некодирующая РНК специфически процессируется в miRNA, «нацеливающую» антисмысловой транскрипт с отцовской аллели, кодирующей ретротранспозон класса sushi (gypsy) (Davis et al., 2005).