Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Мутация в компонентах пути RNAi приводит, как это ни удивительно, к утрате центромерного гетерохроматина и накоплению некодирующих «прямых» и «реверсных» транскриптов с двунаправленных промоторов в пределах каждого повтора dgwdh (рис. 8.2) (Volpe et al., 2002). У дробянковых дрожжей есть единственный ген для каждого из белков RNAi, Dicer, Argonaute и RdRP (idcrl+, agol+n rdpl+, соответственно). Удаление любого из этих генов приводит к утрате метилирования H3K9 гистонов, и мутанты обнаруживают дефекты в расхождении хромосом, которые обычно связаны с дефектами в сборке гетерохроматина (Provost et al., 2002; Volpe et al., 2003). Более того, секвенирование библиотеки малых РНК дробянковых дрожжей выявило РНК длиной ~22 нуклеотида, которые картировались исключительно в районах центромерных повторов и повторов рибосомной ДНК, позволяя предполагать, что сел PHК могут образовывать dsRNAs, которые процессируются в siRNA (Reinhart and Bartel, 2002. Таким образом, было высказано предположение, что путь RNAi может рекрутировать Swi6 и Clr4 к хроматину для того, чтобы инициировать и (или) поддерживать формирование гетерохроматина в каждом из вышеуказанных локусов (рис. 8.3) (Hall et al., 2002; Volpe et al., 2002).

^{Рис. 8.2. Организация гетерохроматиновых районов хромосомы у S. pombe и A. thaliana}

^{В качестве примера показана центромера хромосомы 1 S. pombe. Уникальный центральный коровый район (cntl) фланкирован «самыми внутренними» (imrL и imrR) и «самыми внешними» (otrL и otrR) повторами. Район otr транскрибируется в обоих направлениях, давая начало прямым (синий) и обратным (красный) транскриптам. Участок между генами mat2 и mat3 содержит домен, который гомологичен центромерным повторам dg и dh (cenH) и также транскрибируется в обоих направлениях. Aftl и Perl — это связывающиеся с ДНК белки, которые действуют параллельно с RNAi, обеспечивая сайленсинг типа спаривания. Центромеры Arabidopsis состоят из повторов длиной 180 п.о. (зеленый), перемежающихся с элементами типа ретротранспозонов (желтый). Показаны прямые транскрипты, инициирующиеся в пределах длинного терминального повтора (LTR), и обратные транскрипты, инициирующиеся в пределах повторов длиной 180 п.о.}

Интересно, что и механизм TGS, и мехнизм PTGS, по-видимому, вносят вклад в даун-регуляцию сел-РНК.

Транскрипт с «прямой» нити в основном сайленсирован на транскрипционном уровне, как это видно на мутантах по RNAi (Volpe et al., 2002). Однако «обратная» нить транскриптов сел не затрагивается мутантами Swi6 (Volpe et al., 2002), и сайленсинг этого «обратного» cen-транскрипта происходит главным образом на посттранскрипционном уровне.

RNAi играет также роль в сайленсировании локуса типа спаривания (mat2/3) (Hall et al., 2002). mat2/3 прерывается участком ДНК, который в высокой степени гомологичен центромерным повторам (называется cenH — cenHomology) (рис. 8.2). Подобно повторам сел, район cenH транскрибируется дивергентно, образуя «прямые» и «обратные» РНК (Noma et al., 2004). Эти транскрипты cenH у мутантов по RNAi накапливаются до высоких уровней. Напротив, RNAi не является необходимой для сайленсинга репортерного трансгена, вставленного в mat2/3, если сайленсинг не был сначала как-то нарушен. Причина этого различия в том, что частично избыточный механизм сайленсинга, включающий два связывающихся с ДНК белка, Perl и Atfl, которые связываются с mat2/3, рекрутирует гетерохроматиновую машинерию независимо от RNAi (Jia et al., 2004). Этого достаточно для сайленсирования репортерного гена в отсутствие RNAi, но недостаточно для предотвращения накопления некодирующих транскриптов cenH (рис. 8.2).

4. Малые РНК инициируют сборку гетерохроматина в связи с эффекторным комплексом RNAi

В связи с открытием, что путь RNAi участвует в формировании гетерохроматина у дробянковых дрожжей и в транскрипционном сайленсинге генов в других системах возник вопрос о том. каким образом этот путь может непосредственно регулировать структуру хроматина. Очистка Chp1, хромодоменного белка, являющегося структурным компонентом гетерохроматина, привела к идентификации комплекса RITS (Verdel et al., 2004). RITS, кроме Chp1, содержит белок Ago1, характерный для дробянковых дрожжей, и Tas3, белок с неизвестной функцией. Он также содержит центромерные siRNAs, которые создаются рибонуклеазой Dicer, и, что важно, RITS связывается с районами центромерных повторов зависимым от siRNA образом. Поэтому предположили, что RITS использует центромерные siRNAs для «нацеливания» на специфичные хромосомные районы для инактивации, и это обеспечивает прямую связь между RNAi и сборкой гетерохроматина (рис. 8.4).

^{Рис. 8.3. Сборка гетерохроматина включает совместное действие модифицирующих гистоны энзимов (HDACs и Clr4) и связывающихся с гистонами белков (например, Swi6) и может направляться механизмом КТФш}

^{Деацетилирование HDACs сопровождается рекрутированием Clr4 и метилированием H3K9 гистонов. Swi6 связывается с метилированными по H3K9 «хвостами» гистонов, и в результате последовательных циклов метилирования H3K9, сопряженных с олигомеризацией Swi6, происходит распространение гетерохроматина}

Подобно RISC, опосредующему PTGS, RITS использует siRNAs для прицельного распознавания. Однако в отличие от RISC RITS связывается с хроматином и инициирует формирование гетерохроматина в противоположность инактивации иРНК. Каким образом siRNAs могут «нацеливать» на определенные, специфичные хромосомные участки? Предложены два возможных механизма. Согласно первой модели, siRNAs, связанные с Ago1 в комплексе RITS, должны как-то соединяться с нераскрученной двойной спиралью ДНК за счет спаривания оснований. Во второй модели связанные с RITS siRNAs должны спариваться основаниями с некодирующими РНК-транскриптами в локусе-мишени (рис. 8.4)

Согласно любой из этих моделей, в результате ассоциации RITS с хроматином посредством siRNAs рекрутируется HKMT Clr4 с последующим метилированием гистонов по H3K9. За этим следуют связывание Swi6 и распространение метилирования H3K9 и гетерохроматина. Однако для ассоциации RITS с хроматином требуется также Clr4, позволяя предполагать, что это обеспечивает метилированные H3K9, к которым может присоединяться комплекс RITS, стабилизируя тем самым свою связь с хроматином. Уже известно, что хромодомен Chp1 специфически связывается с метилированными остатками H3K9 (Partridge et al., 2002), а мутации в Clr4 или хромодомене Chp1, участвующие в этом взаимодействии, приводят к утрате связывания RITS с хроматином (Partridge et al., 2002; Noma et al., 2004). Более того, RITS может также связываться с доменами хроматина, покрытыми метилированным H3K9, через хромодомен Chp1 в mat2/3 и теломерных районах в отсутствие siRNAs (Noma et al., 2004; Petrie et al., 2005). Подводя итог, можно сказать, что комплекс RITS обнаруживает сродство с хроматином через связывание Chp1 с метилированными H3K9 и через спаривание оснований siRNA либо с ДНК, либо с транскриптами РНК.

Недавно полученные данные являются сильным свидетельством в пользу роли RITS и siRNAs в инициации сборки гетерохроматина. Бюлер и соавторы (Buhler et al., 2006) использовали сайт-специфичный белок, связывающийся с РНК, чтобы искусственно привязать комплекс RITS к РНК-транскрипту активного в норме гена ura4+. Замечательно, что результатом такой привязки стала генерация siRNAs ura4+ и сайленсинг этого гена ura4+ по типу, требующему как RNAi, так и компоненты гетерохроматина. Кроме того, эта система позволяла прямо оценивать способность вновь возникших siRNAs инициировать метилирование H3K9 и связывание Swi6, которые являются молекулярными маркерами образования гетерохроматина. Интересно, что вновь образовавшиеся siRNAs ura4+ оказались под негативным контролем со стороны консервативной siRNA-рибонуклеазы, Eri1, которая ограничивает их тем локусом, с которого они были произведены. Однако, когда ген, кодирующий Eri1, делегируется, siRNAs ura4+ способны действовать в trans-конфигурации и сайленсировать вторую копию гена ura4+. вставленную в другую хромосому той же клетки. Этот эксперимент демонстрирует, следовательно, что siRNAs могут действовать как факторы специфичности, направляющие RITS и сборку гетерохроматина на прежде активный район генома.

Рис. 8.4. RNAi и siRNA-направляемая сборка гетерохроматина у S. pombe

^{Для образования siRNA требуются и Dicer, и RDRC. Предполагается, что первоначальное «нацеливание» включает опосредованное RITS и siRNA распознавание похожих транскриптов. Связывание RITS стабилизируется связыванием хромодомена Chp1 с метилированным по H3K9 гистоном. Рекрутирование Clr4 и Swi6 опосредует распространение метилирования по H3K9}

Способность siRNAs инициировать сайленсинг у S. pombe была также исследована другим методом, базирующимся на экспрессии шпилечной РНК для производства siRNAs, гомологичных трансгену GFP (Sigova et al., 2004). В этой системе шпилечные siRNAs стимулировали сайленсинг репортерного гена GFP на уровне PTGS, но не TGS (Sigova et al., 2004). Неясно, почему эти шпилечные siRNAs не могут индуцировать TGS и сборку гетерохроматина в хромосомной копии GFP Одно из возможных объяснений заключается в том, что гетерохроматин собирается в специфических субнуклеарных местах, а сборка вне этих мест происходит неэффективно (Gasser et al., 2004; Глава 4).

5. Синтез dsRNA и образование siRNA

Двунаправленная транскрипция центромерных ДНК-повторов в принципе могла бы обеспечить первоначальный источник dsRNA у дробянковых дрожжей (\blpe et al., 2002). dsRNA, получающиеся в результате отжига «прямых» и «обратных» транскриптов, могли бы затем стать субстратом для рибонуклеазы Dicer. Однако РНК-направляемая PHК-полимераза (Rdpl) и связанные с нею кофакторы, а также HKMT Clr4, также необходимы для производства siRNA рибонуклеазой Dicer (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Эти наблюдения показывают, что образование гетерохроматиновых siRNAs рибонуклеазой Dicer сопряжено с событиями, зависящими от хроматина и Rdpl (рис. 8.4).

Фермент Rdpl находится в мультипротеиновом комплексе, который содержит также Hrrl, РНК-геликазу, и Cidl2, члена [3-семейства ДНК-полимераз, включающего поли(А)полимеразные ферменты (Motamedi et al., 2004). Этот комплекс был назван комплексом РНК-направляемой РНК-полимеразы (RDRC — RNA-direct-ed RNA polymerase complex), и для формирования гетерохроматина в районах центромерной ДНК требуются все его субъединицы (Motamedi et al., 2004). Как ожидалось, на основании присутствия Rdpl RDRC обладает активностью PHК-направляемой РНК-полимеразы in vitro, и мутации, устраняющие эту активность, устраняют и зависимый от RNAi сайленсинг in vivo (Motamedi et al., 2004; Sugiyama et al., 2005). Активность RDRC, обусловливающая синтез РНК in vitro, не требует siRNA-праймера (Motamedi et al., 2004). RITS может, следовательно, обеспечить in vivo специфичность путем рекрутирования RDRC к выбранным РНК-матрицам посредством siRNA. В согласии с этой гипотезой, субъединицы RDRC необходимы для генерации siRNA, а комплексы RITS, изолированные из клеток, не имеющих ни одной субъединицы RDRC, лишены siRNAs (Motamedi et al., 2004; Li et al., 2005; Sugiyama et al., 2005; Buhler et al., 2006).

Присутствие Cidl2 в RDRC интригует и ставит вопрос о возможности участия еще одной полимеразной активности в связанном с хромосомой РНК-сайленсинге. Поскольку некоторые члены этого семейства обладают активностью пол и (А) полимеразы, одна из возможностей заключается в том, что аденилирование dsRNA, произведенной Rdpl, может иметь важное значение для их дальнейшего гтроиессталтъ. Интересно, что Cid 12-подобные белки консервативны у всех эукариот (табл. 8.1); результатом мутаций в Rde-З, характерном для С. elegans члене этого семейства, является дефектная RNAi (Chen et al., 2005), что подтверждает консервативную роль этих ферментов в RNAi-пути.

Имеются данные по синтезу и процессингу dsRNA, связанному с образованием гетерохроматиновых siRNAs, происходящим на хромосоме, в сайтах транскрипции некодирующих центромерные РНК (рис. 8.4). Среди них, во-первых, данные о том, что Rdpl может быть присоединена поперечными сшивками к центромерным ДНК-повторам (Volpe et al., 2002; Sugiyama et al., 2005) и к «прямым» и «обратным» РНК-транскриптам, происходящим из этих районов (Motamedi et al., 2004). Как и в случае поперечных сшивок с ДНК, присоединение поперечными сшивками к центромерным РНК требует участия Dicer и Clr4 и, следовательно, является зависимым от siRNA и хроматина. Во-вторых, для производства siRNA требуются компоненты хроматина, в том числе Clr4, Swi6 и РВФС Sir2 (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Наконец, ассоциация RDRC с RITS зависит от siRNAs, а также от Clr4, что заставляет предполагать, что она происходит на хроматине (Motamedi et al., 2004). Таким образом, образование dsRNA и. siRNA гетерохроматина может включать рекрутирование RDRC к связанным с хроматином вновь синтезирующимся пре-иРНК-транс криптам, как это показано на рис. 8.5 (Martienssen et al., 2005; Verdel and Moazed, 2005). Тот факт, что транскрипция и образование siRNA происходят, вероятно, одновременно, усиливает различие между механизмами РНК-сайленсинга, опосредующими модификации хроматина, и PTGS. Однако маловероятно, чтобы это различие было абсолютным. Например, у С. elegans мутации в нескольких компонентах хроматина, подобные мутациям у S. pombe, приводят к дефектам в RNAi и индуцируемом транспозонами РНК-сайленсинге (см. табл. 8.1) (Sijen and Plasterk, 2003; Grishok et al., 2005; Kim et al., 2005), и возникает возможность, что в некоторых случаях синтез и процессинг dsRNA могут происходить на хромосоме независимо от того, происходит ли сайленсинг на уровне TGS или же PTGS.

6. Модели распознавания РНК-РНК versus РНК-ДНК

Крайне важным вопросом при разработке роли RNAi в сборке гетерохроматина является вопрос о том, связывается ли RITS/RDRC с ДНК или же с вновь образующейся РНК. Наблюдение, что компоненты механизма

а Очевидный ортолог хромодоменного белка, Chp1, не был идентифицирован у других модельных организмов, перечисленных здесь, но большинство эукариотических клеток содержит множественные хромодоменные белки. СЬЕЗ у Arabidopsis является хромодоменной ДНК-метилтрансферазой, которая работает в том же пути, что и AG04, и может быть аналогичной Chp1.

⁶ Никакие очевидные ортологи Tas3 не были идентифицированы, но имеет место слабое сходство по аминокислотной последовательности с белком, специфичным для яичника и семенника мыши (NP 035152).

^в Cid 12 относится к большому семейству консервативных белков, имеющих сходство по аминокислотной последовательности с классической поли(А)полимеразой, а также с 2’-5’-олигоаденилатными энзимами.