Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Как обсуждалось ранее, известно, что ряд генов избегают инактивации. Если использовать механистические термины, уход от Х-инактивации приписали редкости «путевых станций» по соседству с этими генами или присутствию граничных элементов, блокирующих распространение Xist-PHK и (или) других компонентов сайленсинга. Имеются некоторые данные о том, что гены, избегающие инактивации, в раннем развитии являются «молчащими», по крайней мере до некоторой степени. Например, в случае гена Smcx мыши уход от инактивации варьирует в зависимости от стадии развития и от типа ткани (Sheardown et al., 1996). Это, следовательно, в большей мере согласуется с обсужденной выше идеей распространения и отступления в контексте сайленсинга аутосомных генов в транслокациях Х;А.

4.7. Х-инактивация у сумчатых млекопитающих

Эутерии и сумчатые млекопитающие разошлись около 130 миллионов лет тому назад. Сумчатые, как и эутерии, используют систему детерминации пола XY (самец):ХХ (самка) и механизм компенсации дозы, в котором одна из двух женских Х-хромосом инактивирована. Как упоминалось ранее, эта неактивная X у сумчатых всегда представлена гомологом, полученным от отца (Хр). Следующее отличие сумчатых от плацентарных млекопитающих заключается в том, что степень сайленсинга генов в отдельных локусах часто варьирует в разных тканях. Имеются также некоторые данные, что нестабильность сайленсинга возрастает в ходе развития и онтогенеза. Это опять-таки напоминает модель распространения и отступления, предложенную для сайленсинга аутосомных локусов у плацентарных млекопитающих. Интересно, что обогащенность элементами LINE на Х-хромосоме возникла после расхождения эутерий и метатерий, так что возможно, что нестабильность сайленсинга на Х-хромосоме сумчатых также связывается с идеей «путевых станций». Более того, отсутствие у сумчатых метилирования в островках CpG, ассоциированных с генами, сцепленными с X, могло бы вносить дополнительный вклад в нестабильность Xi.

Относительно мало известно о молекулярном механизме Х-инактивации у сумчатых и пока еще не идентифицирован у сумчатых гомолог Xist. Отсутствие гомолога Xist не исключает, конечно, существования негомологичной РНК, выполняющей ту же функцию, что и инициатор Х-инактивации, но пока ничего подобного не было найдено. Единственные два свойства, однозначно общие для неактивной X у эутерий и сумчатых млекопитающих, — поздняя репликация в фазе S и маркировка низкими уровнями ацетилирования гистона Н4 (Wakefield et al., 1997).

Ввиду мужской летальности по мутациям, нарушающим компенсацию дозы у других организмов, в том числе у других млекопитающих, удивительно, что сумчатые толерантны к неполной компенсации дозы. Одно из возможных объяснений вытекает из того факта, что Х-хромосома сумчатых несет меньше генов, чем ее гомолог у плацентарных млекопитающих (Graves, 1996; Marshall Graves and Shetty, 2001). Лишь гены, находящиеся на длинном плече Х-хромосомы эутерий, присутствуют на Х-хромосоме сумчатых. Гены, находящиеся на коротком плече, у сумчатых распределены по аутосомам. Большая часть X сумчатых является, таким образом, обедненной генами и конститутивно гетерохроматиновой. Возможно, эта редукция числа генов сделала возможной толерантность некоторых типов клеток к ослаблению компенсации дозы; в то же время это ослабление недостаточно велико, чтобы организм вообще мог обходиться без компенсации. Кроме того сумчатые могут сайленсировать Xi более эффективно в раннем онтогенезе, когда различия в дозах являются, вероятно, наиболее критичными, аналогично тому, что имеет место для импринтированных локусов. Эти два объяснения могут оба играть свою роль

5. Реактивация и репрограммирование Х-хромосомы

5.1. Стабильность Х-инактивации в соматических клетках

Множественные слои эпигенетических модификаций вносят свой вклад в сайленсинг неактивной Х-хромосомы, и в результате репрессированное состояние обычно очень стабильно. Иллюстрацию этого мы находим в ранних экспериментах, где прослеживали способность 5-азацитидина (5azaC), ингибитора метилирования ДНК, вызывать реверсию сайленсинга Х-хромосомы в линиях клеток XX (Mohandas et al., 1981). Наблюдали, что с низкой частотой происходит спорадическая реактивация отдельных генов. Однако анализ клеточных линий, в которых данный ген реактивировался, показал, что другие гены обычно оставались неактивными, как и вся хромосома, если судить о ней на цитогенетическом уровне. Аналогичные данные были получены с использованием TSA в качестве ингибитора деацетилаз гистонов I типа (Csankovszki et al., 2001).

Спорадическая реактивация отдельных сцепленных с X генов наблюдалась также при старении у мышей. Еще резче это выражено у сумчатых, где Х-инактивация не столь стабильна и где в ходе онтогенеза происходит прогрессивная реактивация.

Что можно сказать о роли Xist-РНК? Данные, полученные с использованием клеточных линий человека, продемонстрировали, что утрата района Х-хромосомы, включающей Xist, не приводит к сколько-нибудь заметной реактивации X (Brown and Willard, 1994). Эти результаты удалось подтвердить на линиях мышиных фибробластов, используя условно-нокаутную аллель Xist (Csankovszki et al., 1999). Здесь было показано, что утрата Xist приводит к делокализации вариантного гистона macroH2A с Xi. Более недавние исследования показали, что модификации гистонов, катализируемые комплексами PcG, триметилирование H3 лизина 27 и убиквитинирование H2A также утрачиваются в условно-нокаутных по Xist линиях фибробластов (Plath et al., 2004). Была выявлена редкая спорадическая реактивация отдельных генов, которая была усилена воздействием 5azaC или TSA Однако, опять-таки, не наблюдалось никакой явной реактивации всей хромосомы. Таким образом, удаление множественных эпигенетических меток сайленсинга еще не достаточно для реверсии сайленсинга всей хромосомы.

Избыточность механизмов сайленсинга Xi в соматических клетках часто называют системой «сдержек и противовесов» [«belts and braces»]. Предполагается, что индивидуальные уровни эпигенетического сайленсинга являются и самоподдерживаюшимися, и поддерживаемыми с помощью механизмов положительной обратной связи. Аналогичные механизмы положительной обратной связи наблюдали и в других эпигенетических системах; например, связь поддержания метилирования гистонов и метилирования ДНК в перицентрическом гетерохроматине (главы 9 и 18).

5.2. Реактивация Х-хромосомы в нормальном развитии

В то время как Х-инактивация в соматических клетках очень стабильна, существуют обстоятельства в ходе нормального развития, при которых вся Х-хромосома реактивируется. Лучше всего изученный пример — реверсия Х-инактивации в развивающихся примордиальных зародышевых клетках (PGSs, primordial germ cells). У мышей PGCs специфицируются примерно на 7—8-й день развития, вскоре после гаструляции В это время клетки эмбриона уже претерпели случайную Х-инактивацию. Впоследствии развивающиеся PGCs мигрируют вдоль района задней кишки эмбриона и приходят в генитальные гребни, структуры, дающие начало взрослым гонадам. Именно в это время PGCs реактивируют свою Xi (Monk and McLaren, 1981). Это событие совпадает во времени с более общим эпигенетическим репрограммированием, включающим стирание родительских импринтов и деметилирование ДНК по всему геному (дополнительные детали см. главу 20).

Реактивация X в PGCs может указывать на специализированный механизм для ревертирования многослойной структуры гетерохроматина. Наблюдали, что исчезновение экспрессии Xist-PHК коррелирует с реактивацией X, но при условии, что сайленсинг в соматических клетках XX не зависит от Xist, не вполне очевидно, что причина в этом. Возможно, что PGCs не могут установить все метки, ассоциированные с сайленсингом, и поэтому более чувствительны к реактивации. В соответствии с этим находятся данные о том, что в развивающихся PGCs у мышей метилирование островков CpG на Xi не происходит (Grant et al., 1992).

Второй пример реактивации X — это реверсия инактивации импринтированной Хр во время размещения линии ICM эмбрионов на стадии бластоцисты, обсуждавшаяся в разделе 3.5, которая, опять-таки, ассоциирована с более широким кругом явлений репрограммирования генома. Эта реактивация также коррелирует с исчезновением X/S/-PHK и утратой многих эпигенетических меток, связанных с сайленсингом.

5.3. Реактивация Х-хромосомы в ходе экспериментального репрограммирования

Реактивацию X наблюдали также в специальных экспериментальных условиях. Она происходит при пересадке соматических ядер в неоплод отворенные ооциты (Eggan et al., 2000) и после слияния соматических клеток с такими тотипотентными клетками, как ES, эмбриональные зародышевые (EG) клетки или клетки эмбриональной карциномы (ЕС) (см., например, Tada et al., 2001).

Эмбрионы, полученные в результате пересадки ядер, представляют особенно интересный пример. Эксперименты на мышах (Eggan et al., 2000) продемонстрировали быструю реактивацию маркерного гена на Xi у эмбрионов-трансплантатов на стадии дробления. Несмотря на это, ядро сохраняло некоторую память о том, которая X была неактивной, поскольку у клонированных эмбрионов на стадии плода Xi клетки-донора была также Xi в клетках трофэктодермы плаценты. Напротив, клетки собственно эмбриона обнаруживали случайную инактивацию X (рис. 17.9). Предположительно реактивация и репрограммирование X, происходящие в развивающихся ICM, дают эмбриону еще один шанс перенастроить эпигенетическую информацию от донорского ядра.

Реактивация X в продуктах слияния соматических клеток XX и плюрипотентных эмбриональных клеток изучена хуже. Предполагается, что она происходит также в результате воздействия на соматический геном факторов, присутствующих в клетках ЕС, ES или EG Было продемонстрировано, что реактивация происходит относительно быстро, в пределах примерно 5 суток после слияния, и происходящая на высоком уровне экспрессия Xist исчезает в слившихся клетках после длительного культивирования. Причинная связь этих событий не была показана

5.4. Уроки из опытов с индуцибельными трансгенами Xist

Серия экспериментов с использованием индуцибельных трансгенов Xist в клетках ES очень углубила наше понимание стабильности versus реверсибельности Х-инактивации. Во-первых, было показано, что Xist-РНК может установить Х-инактивацию в недиффернцированных клетках ES и на очень ранних стадиях дифференцировки, но не в более позднее время (Wutz and Jaenisch, 2000). Это называется «окном возможности» [«window of opportunity»]. Оказалось, что эта способность клеток реагировать на Xist-РНК в общих чертах коррелирует с обратимостью Х-инактивации. Так, сайленсинг ревертировал, когда трансген выключался в клетках ES или на ранних стадиях дифференцировки, но не на более поздних этапах дифференцировки и не в соматических клетках.

Рис. 17.9. Регуляция Х-инактивации у клонированных эмбрионов мыши

^{Рисунок иллюстрирует донорскую клетку XX с инактивированной Х-хромосомой (А), покрытой Xist-PHК (зеленая линия) В этой модели транскрипция с донорского ядра, включая Xist-PHK, репрессирована факторами ооцита до 2-клеточной стадии, приводя к реактивации X. Затем, на 2-клеточной стадии экспрессия Xist возобновляется. Затем Xist реэкспрессируется вновь с аллели неактивной X от донорской клетки. Это можно было бы приписать сохранению такой метки, как метилирование ДНК в промоторе Xist Этот паттерн поддерживается в клетках, относящихся к линиям ТЕ и РЕ, но не в плюрипотентном эпибласте, где экспрессия Xist вновь прекращается, приводя ко второму событию реактивации. В ICM стирание эпигенетических меток, управляющих экспрессией донорского Xist, делает возможной последующую случайную Х-инактивацию в собственно эмбрионе}

Возвращаясь к реактивации и репрограммированию X, можно сказать, что данные по индуцибельным трансгенам означают, что в определенных клеточных условиях, а именно, в недифференцированных клетках ES. инактивация X произойдет, когда исчезает экспрессия Xist-РНК. Если мы посчитаем, что те клетки, для которых документально доказано, что в них происходит реактивация X (т. е. клетки PGCs, ICM, клетки EG и ЕС), все сходны с клетками ES в отношении плюритпотентности и пластичности, тогда прекращение экспрессии Xist может во всех случаях лежать в основе реактивации X.

6. Резюме и направления будущих исследований

В последние годы имел место значительный прогресс в нашем понимании молекулярного механизма Х-инактивации. До сегодняшнего дня этот прогресс подпитывался успехами в смежных областях эпигенетических исследований и, в свою очередь, стимулировал успехи в других областях. Примером последнего может служить растущее количество данных о том, что некоторые кластеры импринтированных генов регулируются cis-активными некодирующими РНК во многом так же, как Xist регулирует Х-хромосому (глава 19). Имеются все основания думать, что этот взаимодополняющий прогресс продолжится.

Однако многие вопросы остаются без ответа, и замечательно, что несмотря на более чем 40-летние исследования мы все еще не понимаем, даже в общих чертах, механизмы, участвующие в «счете» и «выборе». Гипотеза блокирующего фактора, которой уже больше 20 лет, представляет собой привлекательное концептуальное руководство к действию, но природа самого блокирующего фактора, если он существует, остается неизвестной. Прогресс был достигнут в определении cis-действующих последовательностей и trans-действующих факторов, регулирующих счет, и их дальнейшая расшифровка является стимулирующим вызовом. Аналогичным образом, хотя мы и знаем сейчас кое-что о модифицирующих хроматин комплексах, участвующих в поддержании Х-инактивации — например, комплексах группы Polycomb, — сигнал для установления сайленсинга по всей хромосоме, включаемый Xist-РНК, остается неизвестным. Возможно в связи с этим нам необходимо понять механизм деацетилирования и деметилирования гистонов на неактивной Х-хромосоме. Необходимо найти ответы и на другие ключевые вопросы: как сайленсинг распространяется по хромосоме и какую роль в этом процессе и в стабилизации — поддержании «молчащего» состояния — играют (если играют) «путевые станции» (возможно, элементы LINE). Это может иметь отношение к интригующему вопросу о том, каким образом Х-инактивация ревертирует в некоторых типах клеток и на некоторых стадиях развития, но оказывается по существу необратимой в других случаях. Этот последний вопрос имеет отношение к более широкой и критически важной теме, связанной с пониманием пластичности генома и репрограммирования в ходе развития.

Литература

Beutler Е., Yeh М. and Fairbanks V.F., 1962. The normal human female as a mosaic of X-chromosome activity: Studies using the gene for glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency as a marker. Proc. Natl. Acad. Sci. 48: 9-16.