Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 17.4. Регуляция гена Xist в раннем развитии

^{Рисунок иллюстрирует современные знания и модели импринтированной и случайной регуляции Xist у ранних мышиных эмбрионов XX. Аллель Xm гена Xist приходит в зиготу с репрессивным импринтом, возможно опосредованным антисмысловым локусом Tsix (черный квадратик). Аллель Хр готова к тому, чтобы быть активной, и экспрессируется как только на 2-клеточной стадии происходит активация эмбрионального гена. Со стадии 2 клеток до стадии морулы Хр Xist экспрессируется во всех клетках (экспрессия показана открытым прямоугольником и стрелкой на 5’-конце). Этот паттерн поддерживается на стадии ранней бластоцисты и впоследствии в клетках ТЕ и РЕ и производных от них полностью дифференцированных тканей. В ICM поздней бластоцисты экспрессия Xist прекращается, возможно с помощью ICM-специфичного репрессорного фактора (голубой треугольник). Впоследствии экспрессия Xist начинается во время гаструляции. Здесь блокирующий фактор (черный ромб) гарантирует, чтобы экспрессия Xist не могла происходить на одной из двух аллелей (счет)}

У анеуплоидных или полиплоидных по Х-хромосоме мышиных эмбрионов результат случайной и импринтированной Х-инактивации различен. Простую иллюстрацию этого дают эмбрионы ХО. При импринтированной Х-инактивации эмбрионы XmО являются нормальными, но развитие эмбрионов ХрО замедлено, поскольку клетки пытаются инактивировать свою единственную Х-хромосому, нарушая тем самым развитие экстраэмбриональных тканей. При случайной Х-инактивации клетки считают число своих Х-хромосом (подчиняясь правилу п—1) и таким образом поддерживают единственную Х-хромосому активной, независимо от того, является ли она Xm или Хр. и поэтому не страдают.

Случайный способ Х-инактивации требует, чтобы клетки обладали средствами для определения числа присутствующих Х-хромосом, нередко называемого «счетом» Популярной моделью для объяснения счета является модель блокирующего фактора, предложенная Растаном (Rastan, 1983). Она предполагает, что единственный Xic (аллель Xist) блокирован во всех клетках, обозначая тем самым активную Х-хромосому. Дополнительные Xic (аллели Xist), там где они имеются, экспрессируются, индуцируя таким образом Х-инактивацию (рис. 17.5). Модель Растана предполагает, что Х-инактивация есть состояние «по умолчанию», заключающееся в том, чтобы сохранять одну Х-хромосому активной. Хотя может показаться, что модель противоречит интуиции, она обладает важным достоинством, объясняя большинство сделанных до сегодняшнего времени экспериментальных наблюдений. Природа блокирующего фактора остается, однако, неизвестной.

Наше понимание механизмов, регулирующих экспрессию Xist и инициацию Х-инактивации, очень выиграло от использования клеток ES, культивируемых in vitro. Клетки ES получаются из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, говоря конкретнее, из ICM (рис. 17.4). Они остаются недифференцированными при культивировании в сыворотке с добавкой лейкемического ингибиторного фактора (LIF, leukemia inhibitory factor). Дифференцировку in vitro можно включить удалением LIF из культуральной среды и пересевом клеток на чашки, изготовленные из неадгезивного пластика. В этих условиях они округляются, агрегируют и формируют эмбриоидные тела, внутри которых они дифференцируются, на протяжении всего нескольких дней, во много разных соматических клеточных типов В недифференцированном состоянии ES-клетки XX обладают двумя активными Х-хромосомами. Когда индуцируют дифференцировку этих клеток, большинство клеток эмбриоидного тела претерпевают случайную Х-инактивацию. Напротив, в дифференцированных ES-клетках XY экспрессия Xist и Х-инактивация не происходят Таким образом, ES-клетки представляют собой ценную модельную систему, потому что они поддаются генетическому манипулированию с использованием «нацеливания» на гены, и, таким образом, на них можно изучать различные этапы процесса Х-инактивации. Ключевым экспериментом явилась демонстрация того, что делеция участка длиной 65 т. п.н., локализованного непосредственно «вниз по течению» от Xist, приводит к экспрессии Xist этой аллелью (и, как следствие, к инактивации) даже в дифференцирующихся ES-клетках XY (Clerc and Avner, 1998). Это означает, что делетированные последовательности необходимы для связывания предполагаемого блокирующего фактора. Дальнейшая характеристика участка, ответственного за это, была достигнута с помошью стратегий «замещения — нацеливания», позволяющих получать делеции более мелких участков в пределах этих 65 т. п.н. (рис. 17.6). Определение ключевых элементов и идентификация связывающихся с ними факторов являются главными целями будущих исследований.

Рис. 17.5. Модель блокирующего фактора для случайной инактивации Х-хромосомы

^{Модель блокирующего фактора предполагает, что имеется некий фактор (желтый кружок), который во всех клетках блокирует единственную аллель Xist (зеленый прямоугольник), так что в начале Х-инактивации эта хромосома защищена от идущей Х-инактивации. В мужских клетках (а) присутствует только одна аллель, и блокирующий фактор всегда связывается с нею. В женских клетках (б) существует равная вероятность, что блокирующий фактор свяжется либо с аллелью XmXist (красный цвет), либо с аллелью Хр Xist (синий цвет). В начале Х-инактивации только незаблокированная аллель будет экспрессировать Xist — РНК (зеленая прерывистая линия). Разные алели цетра Х-инактивации могут иметь большее или меньшее сродство к блокирующему фактору, так что у гетерозиготных самок этот фактор предпочтительно связывается с одной Х-хромосомой. В некоторых случаях это может лежать в основе отклонений от первичной неслучайной X-инактивации (рис. 17.7)}

3.4. Регуляция случайной Х-инактивации — выбор

При некоторых обстоятельствах могут иметь место отклонения от случайной Х-инактивации. Это происходит либо в результате нарушений в первоначальном выборе

Х-хромосомы для инактивации («первичная неслучайная инактивация), либо в результате отбора против клеток, поддерживающих конкретную Х-хромосому в активном состоянии («вторичная» неслучайная Х-инактивация) (рис. 17.7). При первичной неслучайной Х-инактивации на выбор влияют вариации cis-действующих последовательностей или мутации, влияющие на вероятность того, что данная Х-хромосома будет выбрана у гетерозиготных животных как активная или неактивная X. Согласно предложенной Растаном модели блокирующего фактора, эти вариации могут проявлять свое влияние, изменяя вероятность связывания блокирующего фактора с данной аллелью.

Примером первичной неслучайной Х-инактивации является контролирующий Х-хромосому элемент (Хее, X controlling element) у мышей. Хее — классическим образом определенный локус, где разные аллели оказались влияющими на вероятность того, что несущая этот локус Х-хромосома будет активной X у гетерозигот XX (Cattanach and Isaacson, 1967). Опыты по генетическому картированию помещают Хее непосредственно «вниз по течению» от Xist (рис. 17.6) и, следовательно, в правильном положении для того, чтобы влиять на связывание блокирующего фактора, как определяется делецией 65 т. п.н. Лежащую в основе этого изменчивость последовательностей остается идентифицировать.

Второй элемент, который у мышей может влиять на выбор, — это антисмысловой регулятор Tsix (Lee and Lu, 1999). Полагают, что он опосредуется антисмысловой РНК Tsix, которая транскрибируется через локус Xist перед инициацией случайной Х-инактивации (рис. 17.6). Хромосома, несущая делецию промотора Tsix, в клетках XX, претерпевающих случайную Х-инактивацию, инактивируется предпочтительно. Более слабые отклонения наблюдаются у клеток с мутациями в энхансерных элементах (Xite-элементах), которые могут управлять уровнями экспрессии Tsix. Хотя промотор Tsix лежит в пределах района, определяющего предполагаемый сайт связывания блокирующего фактора, опыты с «прицельными» делециями не активируют Xist «по умолчанию» в ES-клетках XY. Это позволяет предположить, что эти локусы не синонимичны, но что делеция промотора Tsix оставляет интактными сайты связывания для блокирующего фактора.

Транскрипция Tsix сопровождается транскрипцией Xist, идущей на низком уровне, перед инициацией случайной Х-инактивации, позволяя предполагать, что влияние на выбор может быть опосредовано двунитевой РНК (т. е. гибридными нитями Tsix: Xist). В согласии с этим повышение уровня смысловой транскрипции через промоторы Xist находится в противоречии с репрессивным эффектом Tsix и дает в результате аллель с меньшей вероятностью стать активной X в гетерозиготной клетке XX (Nesterova et al., 2003). Подытоживая этот материал, можно сказать, что на рис. 17.6 показаны все различные Xic-элементы, о которых известно, что они влияют на инициацию случайной и импринтированной Х-инактивации, и которые часто описываются с точки зрения их способности влиять на функции счета и (или) выбора.

Рис. 17.6. Гены и регуляторные элементы в районе центра Х-инактивации

^{Ключевой район, регулирующим Х-инактивацию, изображен зеленым цветом. Фланкирующие гены показаны серым цветом Стрелки указывают на промоторы генов Xist (смысловой) и Tsix (антисмысловой). Протяженность соответствующих некодируюших РНК изображена прерывистыми зелеными линиями. Регуляторные элементы, контролирующие экспрессию Tsix, Xite и DXPas34, показаны черным. Районы и локусы, участвующие в выборе Х-хромосомы и счете Х-хромосом, показаны в верхней части рисунка}

3.5. Способы переключения инактивации в раннем эмбриогенезе

Каким образом ранние эмбрионы мыши осуществляют переключение с импринтированного на случайный способ регуляции? До недавнего времени думали, что в обоих случаях инициация Х-инактивации сцеплена с клеточной дифференцировкой (Monk and Harper, 1979). Так, полагали, что линии трофэктодермы и примитивной эндодермы инактивируют Хр в ответ на родительские импринты на Xist, когда они впервые дифференцируются на стадии бластоцисты, в то время как клетки ICM, дающие начало собственно эмбриону, сначала, как думали, стирают импринт Xist, а потом претерпевают случайную Х-инактивацию, когда они дифференцируются в три зародышевые линии на стадии гаструляции. Однако более свежие данные показывают, что инактивация ХР происходит до начала клеточной дифференцировки на стадии дробления зародышей и что она происходит во всех клетках, включая предшественников ICM (Мак et al., 2004; Okamoto et al., 2004). Таким образом, импринтированная Х-инактивация в трофэктодерме и примитивной эндодерме представляет собой реликт паттерна Х-инактивации, устанавливаемого у эмбрионов на стадии раннего дробления. Клетки ICM должны, таким образом, запускать программу для реверсии этой начальной волны импринтированной Х-инактивации (см. рис. 17.4). База для реверсии инактивации Хр неизвестна, но может включать в себя специфичную для ICM программу, которая репрессирует экспрессию Xist на Хр (см. раздел 5).

4. Воспроизведение и поддержание неактивного состояния

4.1. Xist-PHK, сайленсинг генов и сборка гетерохроматина

Так что же делает ген Xist? Имеются убедительные данные, что ген Xist и его продукт, РНК, обеспечивают как переключатель, инициирующий Х-инактивацию в cis-конфигурации, так и средство распространения сайленсинга по хромосоме. Данные показывают, что (1) Xist уникален в том отношении, что он экспрессируется только с Xi, (2) уровни Xist-РНК резко возрастают у предимплантационных эмбрионов во время Х-инактивации, (3) ап-регуляция Xist предшествует Х-инактивации и, по-видимому, является абсолютно необходимой для нее, (4) Xist-РНК колокализуется с Xi в интерфазных ядрах и распределяется по одной из двух метафазных Х-хромосом (см. рис. 17.3) и (5) содержащие Xist трансгены, будучи вставлены в аутосомы, могут индуцировать по крайней мере некоторые свойства неактивного хроматина. В результате (сверх)экспрессии аутосома в cis-конфигуpaции покрывается продуктом, и параллельно возникает подобная гетерохроматину, транскрипционно «молчащая» структура хроматина (Heard et al., 1999 и помещенные там ссылки). Эти открытия заставляют предположить, что Xist-РНК и необходима, и достаточна для включения формирования гетерохроматина и транскрипционного сайленсинга. Однако продолжающаяся экспрессия Xist не требуется для поддержания Х-инактивации. Например, у гибридов соматических клеток человека и грызуна, где экспрессия Xist утрачена на Xi-хромосоме человека, которая сохраняется на фоне хромосом грызуна, поддерживается сайленсинг генов, сцепленных с Х-хромосомой (Brown and Willard, 1994). Эта тема обсуждается далее, в разделе 5.

Важно отметить, что ассоциация Xist-PHK с Xi избирательна. Она не обнаруживается вдоль PAR (которое остается активным и эухроматиновым) или в конститутивном (центрическом) гетерохроматине. Более того, анализ метафазных хромосом демонстрирует локализацию в виде бэндов, которая, по-видимому, коррелируете G-светлыми полосами (бэндами), обогащенными генами (см. рис. 17.3) (Duthie et al., 1999). Эти наблюдения показывают, что Xist-РНК покрывает лишь определенные районы хроматина (обсуждается далее в разделе 4.5)

Механизм (механизмы), посредством которого Xist-PHK осуществляет изменения в структуре хроматина и связанный с ним сайленсинг генов в деталях остаются все еще непонятными. Мы знаем, что разные участки молекулы Xist-PHК ответственны за сайленсинг генов и распространение вдоль Х-хромосомы. Эксперименты с системой индуцибельной экспрессии Xist в мышиных ES-клетках, в которой можно было протестировать функции молекул Xist, несущих определенные делеции, показали, что сайленсинг можно приписать консервативной повторяющейся последовательности на 5’-конце этой молекулы, тогда как покрытие Х-хромосомы опосредуется последовательностями, разбросанными по всей остальной части молекулы (Wutz et al., 2002).

4.2. Гетерохроматиновая структура неактивной Х-хромосомы

Со времени самых ранних светомикроскопических исследований вполне осознавали, что Xi обладает свойствами, общими с гетерохроматином. Подобно конститутивному гетерохроматину, обнаруживаемому в центромерах и вокруг них, Xi остается видимой и, вероятно, конденсированной на протяжении всей интерфазы (в виде тельца Барра), и ее ДНК обычно реплицируется в поздней фазе S. Говорится, что Xi состоит из факультативного гетерохроматина. Однако важно помнить, что ДНК конститутивного гетерохроматина обычно обогащена специфическими, повторяющимися сателлитными последовательностями, которые ответственны, по крайней мере частично, за его характерные свойства. ДНК Х-хромосомы не обнаруживает подобной обогащенности, хотя и демонстрирует более слабые различия в специфических повторяющихся элементах, которые могут играть роль в процессе инактивации (см. раздел 4.5). Кроме того, хотя хроматин Xi часто описывается как «конденсированный», тщательный микроскопический анализ и ЗБ-реконструкция хромосом Ха и Xi, помеченных специфичным к ДНК Х-хромосомы зондом, позволяют предполагать, что различие между ними является в большей мере вопросом формы, чем количества хроматина на единицу объема (Eils et al., 1996).

Дальнейшие параллели между Xi и конститутивным гетерохроматином последовали в результате использования непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии для изучения распределения модификаций и вариантов гистонов по метафазным хромосомам и в интерфазных ядрах. Факультативный гетерохроматин неактивной Х-хромосомы и в клетках человека, и в клетках мыши обеднен ацетилированным гистоном Н4 (Jeppesen and Turner, 1993) и в этом отношении напоминает конститутивный, центрический гетерохроматин. Это явилось первой демонстрацией того, что неактивная Х-хромосома маркирована модификацией гистонов специфического типа. Последующие эксперименты, проведенные в нескольких лабораториях, подтвердили эти наблюдения и показали далее, что ацетилированные изоформы всех четырех коровых гистонов (H2A, H2B, H3 и Н4) обеднены и конститутивным, и факультативным гетерохроматином в интерфазных и метафазных клетках (O’Neill et al., 2003 и помещенные там ссылки). В частности, и центрический гетерохроматин, и Xi обеднены H3, ди- и три-метилированным по К4 (H3K4me2 и H3K4me3). Обычно полагают, что эти последние, как и ацетилирование, являются маркерами транскрипционно активного (или потенциально активного) хроматина.

Ситуация становится сложнее, когда рассматривается появление меток, ассоциированных с транскрипционным сайленсингом, а не изчезновение меток, связанных с транскрипционной активностью. Например, гистоны H3, ди- и триметилированные по К9 (H3K9me2/3), — характерные метки транскрипционно «активных» генов, и с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии нередко можно видеть, что они обогащены центическим гетерохроматином (Lachner et al., 2003). Однако по ряду технических и биологических причин, обогащенность ими Xi выглядела неопределенной. По этой причине, следует подчеркнуть значение специфичности антител для получения надежных результатов иммунофлуоресценции Например, лизины 9 и 27 в H3 оба являются частью тетрапептидного ARKS, и антитела, полученные против одного, могут давать перекрестную реакцию с другим. Такие перекрестные реакции должны быть тщательно исключены, прежде чем полученные результаты можно будет надежно интерпретировать. Кроме того, использованная процедура иммунизации и использованный иммуноген могут влиять на тонкую специфичность антисывороток. Например, антисыворотки к H3K9me3, полученные с поперечносшитыми [cross-linked] пептидами, сильнее связываются с этим модифицированным гистоном, когда он находится в гетерохроматиновом районе, чем когда он в эухроматине (Maison et al., 2002). Антисыворотки, полученные таким образом, являются ценными реагентами ддя исследований по гетерохроматину, но не идеальными ддя количественных сравнений гетерохроматина и эухроматина. Наконец, было отмечено, что усиленное иммунофлуоресцентное окрашивание в интерфазе может быть просто результатом более высокой плотности нуклеосом в гетерохроматине (Perche et al., 2000).

Тщательный анализ распределения модификаций гистонов по Xi в культивируемых клетках человека позволил глубже проникнуть в сложность этой системы (Chadwick and Willard, 2004). Определенные и неперекрывающиеся районы в Xi обогащены H3K9me3 и H3K27me3. Таким образом, в отличие от утраты ацетилирования, обогащенность этими модификациями является региональным, а не общим свойством Xi. Любопытно, что районы, обогащенные H3K27me3, оказываются также обогащенными Xist-РНК и вариантным гистоном макроH2A1.2 (Costanzi and Pehrson, 1998). Каким образом макроH2A1.2 мог бы ассоциироваться с Xi и какова его возможная роль в процессе инактивации — эти вопросы обсуждаются далее, в разделе 4.4. Напротив, те районы Xi, которые обогащены H3K9me3, показывают также повышенные уровни гетерохроматинового белка НР1 (о котором известно, что он связывается с метилированными H3K9) и H4K20me3 (метка, также ассоциированная с конститутивным, центрическим гетерохроматином). Важно отметить, что иммуноокрашивание тельца Барра в интерфазных клетках показало такие же паттерны совместного окрашивания, что заставляет предполагать, что различные домены сохраняются на протяжении всего клеточного цикла.