Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

1.1. Гипотеза

В клетках млекопитающих метилирование цитозина происходит преимущественно в динуклеотидах CpG (рис. 18.1). Мысль о том, что метилирование ДНК у животных могло бы представлять механизм клеточной памяти, возникла независимо в двух лабораториях (Holliday and Pugh, 1975; Riggs, 1975). Отдавая себе отчет в том, что динуклеотид CpG является самокомплементарным, обе группы предположили, что паттерны метилированных и неметилированных CpG могли бы копироваться при делении клеток. Сразу же после репликации ДНК родительская нить ДНК сохраняла бы свой паттерн модифицированных цитозинов, но вновь синтезированная нить была бы немодифицированной. Для того чтобы обеспечить копирование родительского паттерна на эту дочернюю нить, они постулировали существование «поддерживающей метилтрансферазы», которая метилировала бы исключительно те CpG, которые спарены основаниями с метилированным родительским CpG. Неметилированные CpG не являлись бы субстратом для поддерживающей метилтрансферазы (рис. 18.2). Следствием работы этого простого механизма была бы полуконсерватавная репликация паттернов метилирования ДНК, подобно нуклеотидной последовательности самой ДНК

1.2. Данные о наследуемых паттернах метилирования

Паттерн метилирования ДНК в единичном геномном локусе первоначально был установлен с помощью рестрикционных эндонуклеаз, чувствительных к метилированию ДНК.

Рис. 18.1. Метилирование цитозинов в ДНК

^{(а) добавление метильной группы (красный цвет) в положении 5 пиримидинового кольца цитозина (черная стрелка) стерически не интерферирует со спариванием оснований ПС (голубые линии). ДНК-метилтрансферазы ковалентно связываются с углеродом в положении 6 (зеленая стрелка) во время переноса метильной группы (б) Модель В-формы ДНК, метилированной по цитозинам в двух самокомплементарных последовательносях CpG. Спаренные метальные части (пурпурный и желтый цвета) лежат в большой бороздке двойной спирали}

Многие из этих ферментов не могут расщеплять сходные распознаваемые ими последовательности в ДНК, если имеет место метилирование специфического основания. Паттерн метилированных и неметилированных сайтов был картирован в генах рибосомной РНК Xenopus laevis с помощью таких энзимов, о которых известно, что они расщепляют ДНК по сайтам, содержащим CpG, но блокированы метилированием цитозинов (Bird and Southern, 1978). Нашли, что на конкретной нити ДНК большинство CpG метилированы, но что неметилированные сайты распределены случайным образом. Существенно, что эти сайты были всегда симметричными. Другими словами, либо оба CpG в комплементарной паре были метилированы, либо ни один из них не был метилирован (Bird, 1978). Это открытие вполне соответствовало предсказаниям, сделанным на основе модели поддержания (Holliday and Pugh, 1975; Riggs, 1975). Более прямая проверка наследуемости паттернов метилирования Д Н К стала возможной при использовании трансфекции искусственно метилированной ДНК в культивируемые клетки (Wigler, 1981). Неметилированные плазмиды обычно не становятся метилированными, даже после многих клеточных поколений. Однако плазмиды, которые были метилированы по сайтам CCGG метилтрансферазой M.Hpall, сохраняют свой метилированный статус на протяжении многих поколений, хотя надежность этого процесса, по крайней мере у культивируемых клеток, меньше 100 %.

1.3. Поддерживающая ДНК-метилтрансфераза млекопитающих

Прогресс в понимании любого биологического процесса на молекулярном уровне зависит от выделения ключевых игроков. Активность ДНК-метилтрансферазы была довольно рано обнаружена в грубых клеточных экстрактах, но в конечном счете ее удалось очистить как белок с массой, 200 кД (Bestor and Ingram, 1983). Фермент Dnmtl специфичен для CpG и обладает значительной активностью против неметилированной ДНК. Однако предпочтительным ДНК-субстратом для него является ДНК, метилированная по CpG только на одной нити (так называемая полуметилированная ДНК), в силу этого свойства казалось возможным, что это поддерживающая ДНК-метилтрансфераза. Последующие исследования существенно подкрепили этот взгляд, поскольку инактивация Dnmtl в эмбриональных стволовых клетках мыши (табл. 18.1) ведет к утрате метилирования CpG по всему геному (Li et al., 1992). Имеющиеся данные согласуются с точкой зрения, согласно которой Dnmtl поддерживает метилирование ДНК по CpG, завершая метилирование полуметилированных сайтов, как постулировали Риггс с Холлидеем и Пью (рис. 18.2).

2. Происхождение паттернов метилирования ДНК

2.1. De novo метилирование ДНК у ранних эмбрионов

Нам необходимо понять не только то, каким образом паттерны метилирования ДНК стабильно поддерживаются, но и то, как они вообще возникают Ранние эксперименты по трансфекции клеток показали, что неметилированная ДНК, введенная в культивируемые соматические клетки, имеет тенденцию оставаться в неметилированном состоянии спустя много клеточных делений. С другой стороны, ретровирусные провирусы и другие трансгены, введенные мышиным предимплантапионным эмбрионам, становятся стабильно метилированными в клетках животного (Jahner et al., 1982). Это позволяло предполагать, что процесс de novo метилирования ДНК ограничен тотипотентными стадиями эмбриогенеза. Эта идея была проверена с помощью клеток эмбриональной карциномы (ЕС) мышей и, впоследствии, эмбриональных стволовых (ES) клеток в качестве модельной системы. Ретровирусная ДНК была неинфекционной, будучи введенной в эти клетки, в противоположность соматическим клеткам, которые поддерживали инфекционный цикл вируса (Stewart et al., 1982). Кроме того, провирусная ДНК становилась метилированной по динуклеотидам CpG, а уменьшение метилирования путем клонирования их метилированных геномов в бактериях (и тем самым стирание метилирования ДНК) восстанавливало способность к экспрессии вирусного гена. Эти результаты показывали, что метилирование ДНК может сайленсировать экспрессию вирусного генома in vivo, а также что эмбриональные клетки действительно обладают способностью метилировать ДНК de novo. Первоначально была известна только одна ДНК-метилтрансфераза, Dnmt 1, и поэтому считалось, что этот фермент способен de novo метилировать ДНК на этих стадиях развития. Делеция гена Dnmtl, однако, не интерферирует с de novo метилированием провирусной ДНК в ES-клетках (Lei et al., 1996), доказывая, что работают другие ДНК-метилтрансферазы.

Рис. 18.2. Метилирование de novo и поддерживающее метилирование ДНК

^{Отрезок геномной ДНК показан как линия с самокомплементарными парами CpG, маркированными как вертикальные штрихи. Неметилированная ДНК (верхняя часть рисунка) становится метилированной “de novo” благодаря Dnmt3a и Dnmt3b и дает в результате симметричное метилирование в определенных парах CpG. После полуконсервативной репликации ДНК дочерняя нить ДНК спарена основаниями с одной из метилированных родительских нитей (другой продукт репликации не показан). Симметрия восстанавливается поддерживающей ДНК-метилтрансферазой Dnmtl, которая завершает метилирование полуметилированных сайтов, но не метилирует немодифицированные CpG}

2.2. Открытие de novo метилтрансфераз

Все известные прокариотические цитозиновые ДНК-метилтрансферазы обладают общим набором диагностических белковых мотивов (Postfai et al., 1989). Эти особенности были обнаружены и у поддерживающей ДНК-метилтрансферазы Dnmtl. Поиски в базах данных по тегам экспрессируемых последовательностей (EST) выявили три транскрипта, которые потенциально могли кодировать дополнительные ДНК-метилтрансферазы (рис. 18.3). Один из кандидатов, белок Dnmt2, обладает миниальной ДНК-метилтрансферазной активностью in vitro и его отсутствие не оказывает никакого заметного влияния на уровни метилирования ДНК. Другие два кандидата, Dnmt3a и Dnmt3b, кодировали родственные каталитически активные полипептиды, которые, в отличие от Dnmtl, in vitro не проявляли никакого предпочтения в отношении метилирования полуметилированной ДНК (Okano et al., 1998). Дизрупция генов, кодирующих Dnmt3a и Dnmt3b у мышей, подтвердила, что эти белки представляют собой недостающие de novo метилтрансферазы (табл. 18.1), поскольку ES-клетки и эмбрионы, лишенные этих белков, были неспособны к метилированию de novo провирусных геномов и повторяющихся элементов (Okano et al., 1999). Более того, мужские и женские зародышевые клетки, лишенные белка Dnmt3a или ассоциированного регуляторного фактора, Dnmt3L, не могли установить отличающиеся паттерны метилирования в импринтированных генах (табл. 18.1) (Hata et al., 2002; Kaneda et al., 2004). В то время как инактивация и Dnmt3a, и Dnmt3b приводила к ранней эмбриональной летальности, утрата любого из этих генов вызывала серьезные дефекты, приводящие к постнатальной (Dnmt3a) или эмбриональной (Dnmt3b) летальности. Доказательства аналогичной роли у человека появились с открытием, согласно которому синдром ICF, редкое состояние, характеризующееся иммунодефицитом, центромерной нестабильностью и лицевыми аномалиями, связан с мутациями в гене, кодирующем Dnmt3b (Ehrlich, 2003). Анализ геномной ДНК лимфобластоидных клеток, взятых от больных ICF, показало пониженный уровень метилирования генома, особенно в повторяющихся последовательностях ДНК, ассоциированных с перицентромерными районами хромосом.

2.3. Островки CpG и паттерны метилирования ДНК

ДНК из соматических тканей млекопитающих метилирована в 70 % всех сайтов CpG (Ehrlich, 1982). Исследования по картированию (см. врезку на с. 338) показывают, что в число высокометилированных последовательностей входят сателлитные ДНК, повторяющиеся элементы, в том числе транспозоны и их инертные остатки, неповторяющаяся межгенная ДНК и экзоны генов. Среди этих категорий нуклеотидных последовательностей ДНК при метилировании, по-видимому, нет очевидного предпочтения последовательностей какого-то одного типа по сравнению с другим. CpG в сателлитных ДНК метилируются в общем в той же степени, что и CpG в перемещающихся элементах или экзонах. Таким образом, большинство последовательностей метилируются в соответствии с частотой находящихся в них динуклеотидов CpG, которая обычно отражает состав их оснований. Ключевыми исключениями из этого глобального метилирования являются островки CpG. Островки CpG были выявлены как фракция ДНК позвоночных, которая необычно часто расщепляется рестрикционными ферментами, чувствительными к метилированию ДНК (Cooper et al., 1983). Клонирование этих так называемых «крохотных HpaII-фрагементов» показало, что они происходят из последовательностей, обогащенных CpG и имеющих длину около 1 т. п.н., которые не метилированы в зародышевых клетках, у ранних эмбрионов и обычно также во всех соматических тканях (Bird et al.. 1985). Островки CpG (рис. 18.4) являются поэтому исключением из «глобального» метилирования CpG, преобладающего в большей части генома млекопитающих. Ранние работы по картированию промоторов индивидуальных генов выявили районы, обогащенные GC, вблизи промоторов генов (McKeon et al., 1982), и сейчас очевидно, что большинство (если не все) островки CpG маркируют промоторы и 5’-домены генов. Приблизительно 60 % генов человека имеют промоторы с островками CpG.

2.4. Динамические изменения в паттернах метилирования ДНК в ходе развития

Паттерны метилирования ДНК обнаруживают видимое общее постоянство при исследовании разных типов соматических клеток, хотя локальные изменения в специфических последовательностях ДНК очевидны. Например, островки CpG на одной Х-хромосоме в большом числе становятся de novo метилированными в ходе эмбрионального процесса инактивации Х-хромосомы у самок плацентарных млекопитающих (Wolf et al., 1984). Этот процесс имеет существенное значение для надежного сайленсинга генов на инактивированной хромосоме (рис. 18.4), потому что дефектные по метилированию ДНК мыши или клетки обнаруживают частую транскрипционную реактивацию генов, сцепленных с Х-хромосомой. В транскрипционную активацию некоторых генов во время дифференцировки также вовлечена запрограммированная утрата метилирования ДНК. Например, ген interleukin-2 утрачивает метилирование CpG в своем промоторном районе по мере того, как этот ген становится экспрессируемым в ходе дифференцировки Т-клеток (Bruniquel and Schwartz, 2003). Это деметилирование оказывается существенным предварительным условием для активации гена и является поэтому ключевой частью программы дифференцировки Т-клеток.

Рис. 18.3. Метилтрансферазы ДНК у млекопитающих

^{Каталитические домены членов семейства Dnmtl, Dnmt2 и Втье3 консервативны (сигнатурные мотивы, I, IV, VI, IX и X, наиболее консервативны во всех нитозиновых метилтрансферазах), но между их аминотерминальными регуляторными доменами сходства мало. (PCNA) взаимодействующий с PCNA домен; (NLS) сигнал ядерной локализации; (RFT) домен, «нацеливающий» на фокусы репликации; (СХХС) богатый цистеином домен, который, как предполагается, связывается с последовательностями ДНК, содержащими динуклеотиды CpG; (ВАН) домен «bromo-adjacent homology», участвующий в белок-белковых взаимодействиях; (PWWP) домен, содержащий высококонсервативный мотив «пролин-триптофан-триптофан-пролин». участвующий в ассоциации с гетерохроматином; (ATRX) родственный ATRX богатый цистеином район, содержащий «цинковый палец» С2-С2 и атипичный домен PHD, участвующий в белок-белковых взаимодействиях}

Картирование метилирования ДНК

Чтобы понять функции метилирования ДНК, необходимо сначала выяснить, где оно происходит в геноме. Для этого существуют несколько методов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

¦ Поскольку метилирование ограничено в основном последовательностями CpG, для картирования широко использовали расщепление рестрикционными ферментами, распознающими содержащие CpG нуклеотидные последовательности ДНК (Bird and Southern, 1978). Преимущество этого метода заключается в том, что можно протестировать большие участки генома, но он ограничен динуклеотидами CpG, которые обнаруживаются в сайтах рестрикционных ферментов.

^{¦ Надежный метод тестирования всех цитозинов в данном участке включает бисульфитную модификацию однонитевой ДНК (Frommer et al., 1992). Это приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов, но 5-метилцитозин остается защищенным. В результате цитозины, сохраняющиеся после обработки бисульфитом, идентифицируются как метилированные. Благодаря своей высокой разрешающей способности и позитивной идентификации метилированных цитозинов этот метод является предпочтительным для анализа паттернов метилирования ДНК, хотя детальный анализ больших участков занимает много времени.}