Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 17.7. Модели неслучайной Х-инактивации

^{Первичной неслучайной X-инактивацией обозначают отклонения в первоначальном выборе Х-хромосомы, которая будет инактивирована. Теоретически это могло бы происходить у гетерозиготных самок, где имеется отклонение в вероятности двух аллелей, связывающихся с блокирующим фактором. При вторичной неслучайной Х-инактивации выбор Х-хромосомы, которая будет инактивирована, является случайным, но события клеточного отбора приводят к прогрессивной утрате клеток, инактивирующих одну из двух Х-хромосом. Например, там, где на одной Х-хромосоме имеется вредная мутация, клетки, инактивирующие другую Х-хромосому, хромосому дикого типа, будут предпочтительно теряться}

Возникающая картина — это картина сочетания модификаций гистонов, вариантов гистонов, негистоновых белков и Xist-PHK, взаимодействие которых формирует хроматин с его отличительными свойствами транскрипционного «молчания», репликации в поздней S-фазе, конденсированным внешним обликом и (возможно) ядерной локализацией, которые характерны для Xi. Однако точное функциональное значение отдельных хроматиновых доменов на Xi еще предстоит установить. Важное и беспокоящее наблюдение заключается в том, что частота наблюдаемых доменов широко варьирует от одной клеточной линии человека к другой (Chadwick and Willard, 2004). Это может быть не более, чем подтверждением известной избыточности в системе Х-инактивации (например, как отмечалось ранее, в зрелых клетках сайленсинг поддерживается даже тогда, когда Xist-PHK утрачивается), но это также и предупреждение, что культивируемые клеточные линии, особенно иммортализованные. не всегда являются надежным проводником в том, что происходит в первичных тканях, и уж точно не на ранних стадиях развития.

Модификации гистонов, ассоциированные с эухроматином и факультативным, и конститутивным гетерохроматином, суммированы в табл. 17.1. До сих пор лишь Xi, но не конститутивный гетерохроматин, оказалась обогащенной метилированием H3K27 и убиквитинированием гистона H2A по лизину 119 (H2AK119ub) (Plath et al., 2003; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Smith et al., 2004).

Все модификации, перечисленные в табл. 17.1, ассоциированы с общей, гетерохроматиновой конформацией неактивной Х-хромосомы и были идентифицированы с помощью иммунофлуоресцентного анализа либо метафазных хромосом, либо тельца Барра в интерфазных клетках. Однако локальные изменения в модификациях гистонов могут также играть важную роль на различных этапах процесса Х-инактивации. Такие изменения могут быть идентифицированы с помощью микроскопии высокого разрешения или с помощью иммунопреципитации хроматина (СЫР) для того, чтобы картировать модификации, которые объяснялись в главе 10, внутри или по соседству с критичным районом Xic. Например, в недифференцированных ES-клетках крупный домен, простирающийся более чем на 340 т. п.н. в 5’-направлении от гена Xist, характеризуется гиперметилированием H3K9. Гиперметилирование уменьшается по мере того, как клетки дифференцируются и продолжается Х-инактивация (Heard et al., 2004). В женских ES-клетках тот же общий район хроматина обогащен метилированными H3K27 (Rougeulle et al., 2004), а сайты внутри него обогащены ацетилированными H3 и Н4 (O’Neill et al., 1999). Проводимые в настоящее время исследования должны показать, в какой мере эти локальные модификации гистонов в районе Xic являются ранними каузативными событиями, приводящими в действие процесс Х-инактивации, и в какой степени — событиями, совершающимися «вниз по течению» и являющимися (возможно, существенными) компонентами идущего процесса ремоделинга хроматина.

^{Указаны модификации гистонов, которыми обогащен (+) или обеднен (-) конститутивный и факультативный гетерохроматин по сравнению с эухроматином. Символ «означает, что уровень модификации неотличим сколько-нибудь от эухроматина. (me) — метилирование. Относится ко всем способным ацетилироваться лизинам. Обогащение в локальных «горячих пятнах», но не повсюду. Временное обогащение в некоторых клеточных типах.}

Конститутивный центрический гетерохроматин обогащен метилированной ДНК, прежде всего 5’-метилцитозином в димерах CpG (глава 18). Это согласуется с его низким уровнем транскрипционной активности Как это, возможно, ни удивительно, уровень метилирования CpG на Xi в целом не является существенно более высоким, чем в остальном геноме. Однако специфические «островки» CpG, ассоциированные с «молчащими» генами, в высокой степени метилированы, и экспериментальные данные позволяют предполагать, что метилирование ДНК играет важную роль в стабилизации неактивного состояния. Так, мыши, у которых отсутствуют ферменты, которые либо метилируют немодифицированные до этого CpG (de novo метилтрансферазы ДНК, Dnmta и Dnmtb), либо поддерживают модификацию прежде модифицированных остатков (поддерживающий энзим, Dnmtl), инициируют и осуществляют случайную Х-инактивацию нормальным образом (Sado et al., 2000, 2004). Однако гены на гипометилированной Xi у этих мутантных мышей реактивируются легче, чем Xi у животных дикого типа с нормальными уровнями метилирования (Sado et al., 2000).

4.3. Энзимология модификаций гистонов на Хi

Ферменты, отвечающие за ацетилирование коровых гистонов (HDACs) во время Х-инактивации или за деметилирование H3K4, пока неизвестны. Поскольку ингибитор деацетилазы трихостатин A (TSA, trichostatin А) может предотвращать или, по крайней мере, задерживать появление деацетилированной X в дифференцирующихся женских ES-клетках, есть основания предположить участие HDACs (O’Neill et al., 1999). Однако мы не знаем, какие из 11 HDACs класса I и II отвечают за это вероятнее всего (энзимы класса III не подавляются TSA). Мы не знаем также механизм, ответственный за удаление метилирования H3K4. Ферменты, способные удалять метальные группы с H3K4, находящихся в моно- или диметилированном состоянии, были идентифицированы только недавно, а ферменты, способные деметилировать H3K4 в триметилированном состоянии, еще предстоит открыть. На этом этапе мы не можем исключить, что метилирование H3K4 и (или) деапетилирование гистонов удаляются с Xi путем замещения гистонов или же пассивным образом в ходе репликации ДНК.

В настоящее время мы больше знаем об энзимах, ответственных за помещение модификаций гистонов в нужное место. Метилирование H3K27 выполняется Ezh2/Enxl — гомологом белка группы polycomb (PcG) у Drosophila, энхансером zeste (E(Z)) (Silva et al., 2003) (E(Z)) является метилтрансферазой гистонов (HKTM), функционирующей в комплексе PRC2 PcG (глава 11). PRC2 рекрутируется к Xi во время дифференцировки ES-клеток с такой же кинетикой, что и метилирование H3K27. Интересно, что белки PcG участвуют также в убиквитинизации H2A по лизину 119 на Xi. В частности, белок RinglA/RinglB, коровый компонент комплекса PRC2 PcG, функционирует как лигаза ЕЗ для убиквитинирования H2A. Делеция и Ring 1 А, и Ring 1В приводит к потере убиквитинирования H2A как на Xi, так и по всему геному (de Napoles et al., 2004).

4.4. Последовательность событий, приводящих к Х-инактивации; ES-клетки как модельная система

Мышиные ES-клетки оказались бесценной модельной системой для исследования динамики инактивации Х-хромосомы. Повышенные уровни Xist-РНК и то, как она покрывает одну из Х-хромосом, впервые обнаруживаются в большой доле клеток спустя 1–2 дня дифференцировки. Имеются данные о том, что в ап-регуляции Xist играют роль как транскрипционные, так и посттранскрипционные механизмы (Panning et al., 1997; Sheardown et al., 1997; Rougeulle et al., 2004). Однако в недифференцированных женских ES-клетках Xist транскрибируется с обеих Х-хромосом, а в мужских — с единственной X, но продукт транскрипции, РНК, быстро деградирует, и лишь небольшие его количества выявляются по соседству с локусом Xist. Были представлены данные о том. что по мере дифференцировки имеет место стабилизация Xist-PHK на одной из двух Х-хромосом женских клеток (Panning et al., 1997; Sheardown et al., 1997). Механизм, лежащий в основе этого этапа избирательной стабилизации РНК, остается неизвестным, как и его вклад в общее увеличение содержания Xist-РНК и в покрытие ею хромосомы в cis-конфигурации.

Было обнаружено, что ряд этапов Х-инактивации совпадает с началом аккумуляции Xist-PHК в дифференцирующихся ES-клетках XX. В их число входят рекрутирование белков PcG и ассоциированное с этим метилирование H3K27, моноубиквитинирование H2A, деацетилирование H3K9 и утрата метилирования в H3K4 (Heard et al., 2001; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Rougeulle et al., 2004). Глобальное деацетилирование гистонов — относительно позднее событие, происходящее в большинстве клеток на 3—5-й день; поэтому весьма вероятно, что оно участвует в поддержании и (или) стабилизации неактивного состояния, а не в его инициации (Keohane et al., 1996). Такая трактовка предполагает, что паттерны ацетилирования в промоторах отдельных генов, претерпевающих инактивацию, отражают паттерны, определяемые с помощью иммунофлуоресцентного анализа целой хромосомы или крупных доменов. Первоначальные исследования с использованием ChIP, заставляют предполагать, что это действительно так, однако необходимы дальнейшие эксперименты с вовлечением большего числа генов (O’Neill et al., 2003).

Аккумуляция вариантного гистона macroH2A1.2 на Xi происходит в ходе дифференцировки ES-клеток XX гораздо позже (Mermoud et al., 1999). Этот вариантный гистон имеет более 200 дополнительных аминокислотных остатков в своем карбокситерминальном конце и несколько аминокислотных замен по всей молекуле. Интересно, что в соматических клетках экспрессия Xist-PHK требуется для того, чтобы сохранить macroH2A на Xi (Csankovski et al., 1999), но ее недостаточно, чтобы рекрутировать macroH2A на ранних этапах дифференцировки (Mermoud et al., 1999; Wutz et al., 2002).

Избирательное метилирование ДНК на Xi — еще более позднее событие в ES-клетках, Динуклеотиды CpG, о которых известно, что они высокометилированы HaXi во взрослых клетках, не становятся метилированными в женских ES-клетках до гораздо более поздних стадий дифференцировки, 14—21-го дня (Keohane et al., 1996). Это согласуется с результатами в самом развивающемся эмбрионе (Lock et al., 1987) и с идеей, согласно которой метилирование ДНК отвечает за стабилизацию, или фиксацию неактивного состояния, а не участует в инициации и распространении.

Таким образом, возникающая картина — это картина скоординированной и тщательно регулируемой последовательности событий, посредством которых изменения хроматина на Xi помещаются на место по мере развития (суммировано на рис. 17.8). Замечательно, что некоторые из этих изменений, например деацетилирование гистонов и метилирование ДНК, происходят после того, как клетки начали продвигаться по различным дифференцировочным путям. Создается впечатление, что программа, отвечающая за завершение [completion] Х-инактивации, выполняется независимо от других программ клеточной дифференцировки. Важно, однако, отметить, что в некоторых аспектах случайная Х-инактивация может происходить только после того, как дифференцировка началась. Например, включение экспрессии Xist-трансгенов в недифференцированных ES-клетках переключает различные модификации гистонов, ассоциированные с гетерохроматинизацией, а также переход к репликации в поздней S-фазе (Wutz and Jaenisch, 2000), но сколько-нибудь заметное включение macroH2A отсутствует; только после того как индуцирована дифференцировка клеток, macroH2A ко-локализуется с Xist-РНК на хромосоме, содержащей трансген Xist (Rasmussen et al., 2001). Ассоциация macroH2A с хроматином, покрытым Xist, зависит от постоянного присутствия Xist-РНК (Csankovszki et al., 1999), но не требует транскрипционного сайленсинга, поскольку она видна также в хромосомах, покрытых мутантной Xist-РНК, лишенной районов, необходимых для сайленсинга (Wutz et al., 2002). Таким образом, Х-инактивация может рассматриваться как конечный результат серии параллельных процессов, из которых лишь некоторые являются взаимозависимыми.

Рис. 17.8. Слои эпигенетического сайленсинга накапливаются на Xi в ходе дифференцировки

^{Диаграмма показывает, как пять разных эпигенетических изменений, связанных с транскрипционным сайленсингом. размещаются на неактивной Х-хромосоме на разных стадиях развития и дифференцировки как у развивающегося эмбриона, так и в клетках ES в культуре. В некоторых клеточных типах метилирование H3K27 является временным, преходящим, обнаруживаемым лишь на ранних стадиях дифференцировки, но не у зрелых клеток}

Важно подчеркнуть, что конкретные энзиматические комплексы или модификации гистонов могут играть критическую роль на определенных этапах процесса Х-инактивации, но могут становиться менее важными или избыточными позднее, возможно, после того, как более постоянные механизмы сайленсинга, основанные на метилировании ДНК. будут помешены в нужное место. Например, метилирование H3K27, катализируемое PRC2, является существенным для успешной Х-инактивации на ранних этапах онтогенеза, но необязательным в более поздние сроки.

Следует также отметить, что в ходе установления импринтированной Х-инактивации у предимплантационных эмбрионов может иметь место иной порядок событий. В частности, обогащение H3K27me3 не обнаруживается до 16-клеточной стадии, значительно позже начала экспрессии Xist (стадия 24 клеток) (Мак et al., 2004; Okamoto et al., 2004). Это может указывать на потребность в специфических, регулируемых в развитии кофакторов для рекрутирования комплекса PRC2 PcG kXL

4.5. Распространение «молчащего» хроматина

XIC является существенным для Х-инактивации, и было высказано предположение, что сайленсинг распространяется с XIC; при этом проксимальные гены сайленсируются раньше, чем более дистальные. Одним из объяснений этого могло бы быть, что Xist-РНК распространяется прогрессивно по хромосоме, начиная с сайта своего синтеза. Это согласовывалось бы с результатами экспериментов, в которых трансгены Xist вставлялись в аутосомы и где покрытие такой аутосомы Xist-РНК приводило к сайленсингу генов и изменениям хроматина (см. выше).

Распространение неактивного состояния от XIC широко исследовалось в естественно случающихся транслокациях Х;аутосома. Действительно, такие транслокации прекрасно демонстрируют существование XIC (Rastan, 1983). Было показано, что хроматин, несущий характерные маркеры факультативного гетерохроматина (например, утрата ацетилирования гистонов, поздняя репликация и транскрипционный сайленсинг), распространяется от Xi в аутосомную часть гибридной хромосомы (White et al., 1998; Duthie et al., 1999; Sharp et al., 2002). Этим устанавливается важный принцип, согласно которому факультативный гетерохроматин не является исключительным для Х-хромосомы, что согласуется с результатами, полученными с трансгенами Xist, экспрессируемыми на аутосомах. Однако распространение «молчащего» хроматина по аутосомному плечу хромосомы варьирует между транслокациями и ограничено по масштабам.

Существуют две модели, объясняющие ограниченное распространение сайленсинга в cis-сцепленные аутосомы. Во-первых, аутосомы могут сопротивляться начальному распространению Xist-РНК и связанного с этим сайленсинга генов в начале Х-инактивации. В качестве альтернативы можно предположить, что первоначальное распространение на аутосомы могло бы быть эффективным, но сайленсинг может плохо поддерживаться в онтогенезе, что обозначается как «распространение и отступление» [«spread and retreat»]. На сегодняшний день данные говорят в пользу «распространения и отступления», но эти две модели не исключают друг друга, и требуются дальнейшие исследования. Следует заметить, что в раннем развитии против тех клеток, в которых происходит обширный сайленсинг аутосомы, может действовать отбор из-за утраты экспрессии критичных аутосомных генов.

В некоторых транслокациях Х;аутосома распространение является прерывистым, как будто бы перескакивает через определенные районы и оставляет транскрипционно активными эухроматиновые районы, окруженные «молчащими», гетерохроматиновыми районами (Sharp et al., 2002). Распространение конститутивного гетерохроматина в соседние эухроматиновые районы, приводящее к эффекту положения мозаичного типа у Drosophila (глава 5), может обнаруживать сходное поведение. Такие наблюдения легче согласовать с механизмом раннего клеточного отбора, основанным на распространении и отступлении сайленсинга, чем с непрерывным распространением стабильного сайленсинга.

Предположили, что есть элементы, распределенные вдоль Х-хромосомы, называемые «путевыми станциями» [«way stations»], которые служат пунктами сборки гетерохроматина и тем самым усиливают распространение и (или) поддержание Х-инактивации (описано в: Gartler and Riggs, 1983). Эти элементы должны были бы быть менее обычными или, по крайней мере, менее регулярно распределенными на аутосомах. Было высказано предположение, что семейство обычных диспергированных повторов, длинные перемежающиеся повторы (LINES) являются хорошими кандидатами на роль «путевых станций» (Lyon, 1998, 2003). Эти повторяющиеся последовательности обычны в геномах человека и мыши, но особенно часты вдоль Х-хромосомы Более того, элементы LINE наиболее обычны в более конденсированных, бедных генами, G-бэндированных районах геномов человека и мыши, позволяя предположить, что они могут каким-то образом благоприятствовать конформации хроматина, ассоциированной с транскрипционным сайленсингом Недавнее завершение определения нуклеотидной последовательности ДНК Х-хромосомы человека выявило такое распределение элементов LINE, которое в целом согласуется с возможной ролью «путевых станций», но эта идея остается недоказанной.

4.6. Уход от инактивации Х-хромосомы