Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

2.1. Инактивация X регулируется в ходе развития

Инактивация Х-хромосомы у самок млекопитающих регулируется в ходе развития. В ранней зиготе активны обе Х-хромосомы (Epstein et al, 1978), а затем инактивация протекает согласованно с клеточной дифференцировкой В норме существует равная вероятность того, что клетки инактивируют Х-хромосому, полученную ими от матери либо от отца (Xm и Хр, соответственно). Исключением из этого является инактивация импринтированной Х-хромосомы, которая происходит у всех сумчатых и в ранних предимплантационных эмбрионах мышей, где всегда инактивируется Хр. В последнем случае инактивация импринтированной Хр поддерживается в первых клеточных линиях, подлежащих дифференцировке, а именно в клетках экстраэмбриональной троходермы (ТЕ) и примитивной эндодермы (РЕ), но в клетках внутренней клеточной массы (ICM), дающей начало эмбриону, эта неактивная Х-хромосома реактивируется. Реверсия инактивации X происходит также в развивающихся примордиальных зародышевых клетках (PGCs), что обеспечивает вновь активность этой Х-хромосомы в гамете. Рис. 17.2 иллюстрирует цикл инактивации и реактивации X у самок мышей.

2.2. Сайленсинг хромосомы включает множественные уровни эпигенетической модификации

На уровне структуры хроматина сайленсинг Х-хромосомы достигается путем модификации гистоновых «хвостов», включения или исключения вариантных гистонов и метилирования ДНК в богатых CpG «островках»; все это вносит вклад в стабильную структуру гетерохроматина. Слои эпигенетической модификации устанавливаются прогрессивно в ходе онтогенеза, что в деталях описано в разделе 4.4. Все вместе они обеспечивают стабильное воспроизведение неактивной Х-хромосомы в ходе многочисленных раундов клеточных делений.

Вклад отдельных модификаций варьирует как во времени, так и в разных линиях клеток. Например, в соматических клетках высокие уровни H3K27me3 (три-метилирования гистона H3 по лизину 27) требуются на Xi во время раннего развития, но не позже. Напротив, метилирование «островков» CpG необходимо лишь в позднем развитии или не требуется вовсе в клетках трофэктод ермы.

2.3. Некоторые гены избегают Х-инактивации

Х-инактивация затрагивает большую часть Х-хромосомы, но некоторые гены ускользают от сайленсинга. К ним относятся гены в небольшом районе Х-хромосомы, который спаривается с Y-хромосомой в ходе мейоза у самцов и известен как псевдоаутосомный район (PAR), или район спаривания XY (рис. 17.1). Гены, локализованные в этом районе, не требуют компенсации дозы, потому что и у самцов, и у самок присутствуют две копии.

Были охарактеризованы и другие гены-«беглецы» [«дезертиры»], как имеющие сцепленных с Y гомологов, так и не имеющие их. Недавнее исследование показало, что приблизительно 15 % генов на Х-хромосоме человека избегают Х-инактивации (Carrel and Willard, 2005). Интересно, что многие из этих генов лежат в коротком плече хромосомы (обозначаемом как Хр), который относительно недавно приобретен Х-хромосомой в ходе эволюции. Исследования на мышах показывают, что «беглецы» могут быть в раннем онтогенезе инактивированы, а в ходе дальнейшего развития прогрессивно реактивируются (раздел 4.6). У сумчатых большинство изученных генов оказалось в той или иной степени избегающими Х-инактивацию. Это может быть отражением неспособности поддерживать сайленсинг в ходе онтогенеза, которая, возможно, связана с утратой метилирования «островков»

CpG на Xi у этих видов (дополнительные детали см. в Разделе 4.7).

2.4. Х-инактивация регулируется главным локусом-переключателем — центром Х-инактивации

Классические генетические исследования продемонстрировали, что Х-инактивация опосредуется одним cis-действуюшим главным локусом-переключателем [master switch locus], называемым «центр Х-инактивации (Xic)». Было показано, что Xic требуется для сайленсинга Х-хромосомы в cis-конфигурации и для обеспечения корректной и надлежащей инициации случайной Х-инактивации. В более поздних исследованиях Xic был охарактеризован на молекулярном уровне. Этот локус производит большую некодирующую РНК, называемую Xist (Xznactive specific transcript), которая обладает уникальным свойством связываться в cis-конфигурации и накапливаться по всей длине хромосомы, с которой она транскрибируется (см. рис. 17.3) (Brown et al., 1991, 1992; Brockdorff et al., 1992). Покрытие этой хромосомы Xist-PHK создает переключатель для сайленсинга Х-хромосомы (Lee et al., 1996; Penny et al., 1996; Wutz and Jaenisch, 2000). Проведенные до сегодняшнего дня исследования показывают, что это происходит, по крайней мере отчасти, благодаря опосредованному Xist рекрутированию комплексов, модифицирующих хроматин (рис. 17.3).

Вторая некодирующая РНК, Tsixy также локализуется в участке Xic (Lee et al., 1999) и играет ключевую роль в регуляции экспрессии Xist Tsix перекрывается с геном Xist, но транскрибируется в антисмысловом направлении — отсюда его название, соответствующее Xistf прочтенному наоборот!

3. Инициация Х-инактивации

3.1. Импринтированная versus случайная Х-инактивация

Решение инактивировать Х-хромосому должно жестко регулироваться. Мужские клетки должны избежать сайленсинга своей единственной Х-хромосомы, а женские клетки должны избежать сайленсинга обеих Х-хромосом или сохранения обеих Х-хромосом в активном состоянии. Было показано, что здесь используются два разных способа регуляции. Импринтированный способ Х-инактивации обеспечивает сайленсинг Х-хромосомы, полученной от отца. При случайном способе каждая клетка имеет равную вероятность инактивации либо материнской, либо отцовской Х-хромосомы. Млекопитающие-метатерии (сумчатые) используют только импринтированный способ. Млекопитающие-эутерии (плацентарные), по крайней мере в некоторых случаях, используют импринтированный способ в экстраэмбриональных клеточных линиях, но случайный способ в собственно эмбрионе (рис. 17.2). Имеются некоторые указания на то, что у человека используется только случайная Х-инактивация, но это остается не выясненным окончательно.

Рис. 17.2. Цикл Х-инактивации и Х-реактивации

^{Х-хромосома в ходе развития проходит цикл Х-инактивации и Х-реактивации. Красные стрелки указывают на этапы Х-инактивации, а зеленые — на этапы Х-реактивации. Инактивация вначале происходит в ранних предимплантационных эмбрионах (импринтированная Х-инактивация), а впоследствии — в клетках эпибласта во время гаструляции (случайная Х-инактивация). Неактивная Х-хромосома реактивируется в клетках внутренней клеточной массы (ICM). когда они впервые обособляются на стадии бластоцисты, а также в развивающихся зародышевых клетках}

3.2. Регуляция импринтированной Х-инактивации

Отцовски импринтированную Х-инактивацию впервые наблюдали у сумчатого (Sharman, 1971). Впоследствии Такаги и Сасаки (Takagi and Sasaki, 1975) продемонстрировали импринтированную Х-инактивацию в экстра-эмбриональных клеточных линиях ТЕ и РЕ мышиных эмбрионов. Именно происхождение Х-хромосомы от того или другого родителя управляет ее статусом; другими словами, инактивируются отцовские, но не материнские Х-хромосомы, независимо оттого, сколько Х-хромосом или хромосомных наборов присутствуют в клетке. Обратите внимание на то, что единственная Х-хромосома у самцов XYвсегда происходит от матери и, следовательно, не инактивируется в импринтированных тканях.

Какова же тогда природа импринта? Исследования экспрессии Xist, регулирующего Х-инактивацию в cis-конфигурации, показывают, что у мышиных эмбрионов имеется репрессивный импринт на аллели, локализованной в Xm (рис. 17.4). Этот импринт препятствует экспрессии Xist, удерживая Х-хромосому в активном состоянии. Опыты с пересадкой ядер показали, что этот репрессивный А75/-импринт устанавливается во время созревания ооцитов (Tada et al., 2000). Молекулярная основа этого импринта неизвестна, но метилирования ДНК не требуется, в отличие от многих других импринтированных генов (см. детали геномного импринтинга в главе 19).

Одна из теорий предпочтительной инактивации Хр в зиготе заключается в том, что имеет место перенос сайленсинга бивалента XY, который устанавливается на стадии пахитены мейоза у самцов (meiotic sex chromosome /motivation, MSCI) (Huynh and Lee, 2003). Недавние исследования говорят против этого. Во-первых, было показано, что MSCI — отдельный и не зависимый от Xist механизм, включаемый в пахитене присутствием неспаренных участков хромосом, как на половых хромосомах, так и на аутосомах (Turner et al., 2005 и помещенные там ссылки). Во-вторых, анализ экспрессии ряда сцепленных с X генов в ранних зиготах показал, что сайленсинг Хр возникает de novo в ответ на экспрессию Xist зиготической Хр (Okamoto et al., 2005 и помещенные там ссылки).

Экспрессия отцовского Xist (и получающийся в результате этого сайленсинг Хр), начинающаяся в начале зиготической активации гена (на 2—4-клеточной стадии), показывает, что аллель Xist хромосомы Хр готова к экспрессии (рис. 17.4). Однако в мужских соматических тканях Xist всегда репрессирована, откуда следует, что мужские зародышевые клетки должны каким-то образом ремоделировать локус Xist. В соответствии с этим, имеет место специфичное в отношении района деметилирование сайтов CpG в промоторе Xist во время сперматогенеза (Norris et al., 1994).

Рис. 17.3. Прогрессивная гетерохроматинизация всей хромосомы, индуцируемая Xist-РНК

^{(а) Когда ген Xist экспрессируется, синтезируемая РНК связывается с Х-хромосомой, с которой она транскрибируется, и покрывает ее (зеленая прерывистая линия). Считается, что Xist-РНК включает сайленсинг этой хромосомы, рекрутируя активности, модифицирующие хроматин (красные и желтые кружки). Эта первоначальная волна сайленсинга, в свою очередь, приводит к рекрутированию дополнительных слоев эпигенетической модификации (серые кружки), еще более стабилизируя структуру гетерохроматина. Установление этих различных уровней эпигенетического сайленсинга достигается поэтапно в ходе всего развития и онтогенеза. (б) Локализацию Xist-PHК по всем Х-хромосомам показывает гибридизация in situ как в интерфазе, так и в метафазе}

У эмбрионов с анеуплоидией по Х-хромосоме результатом родительских импринтов, управляющих экспрессией Xist, оказываются неправильные паттерны Х-инактивации на ранних этапах развития. Так же обстоит дело у андрогенетических и гиногенетических (или партеногенетических) эмбрионов, у которых оба хромосомных набора происходят, соответственно, либо от отца, либо от матери. Хотя это обычно снижает жизнеспособность эмбриона, некоторые эмбрионы выживают, очевидно исправляя несоответствующие паттерны Х-инактивации, чтобы обеспечить наличие одной активной Х-хромосомы во всех клетках. Полагают, что это связано с преодолением импринта с помощью механизма, в норме регулирующего случайную Х-инактивацию (см. ниже).

Ген Tsix, антисмысловой регулятор Xist, необходим для импринтированной Х-инактивации, поскольку делеция главного промотора приводит к ранней эмбриональной летальности, когда передается материнской, но не отцовской гаметой (Lee, 2000). Летальность, по-видимому, можно приписать несоответствующей экспрессии Xist хромосомы Xm, т. е. неспособности сохранить активную Х-хромосому у эмбрионов как XmY, так и ХгпХр. В настоящее время неясно, является ли экспрессия Tsix-РНК первичным импринтом или же функционирует позже для поддержания импринта.

3.3. Регуляция случайной Х-инактивации — счет

При случайном способе Х-инактивации клетки пользуются правилом п— 1, при котором на каждый диплоидный! хромосомный набор инактивируются все Х-хромосомы кроме одной. Выбор X, которая будет сайленсирована (или сохранится активной) по существу является случайным, хотя некоторые факторы могут влиять на него (см. раздел 3.4). Регуляция Xist при случайной инактивации строго контролируется Исследования показали, что одиночные эмбриональные стволовые (ES) клетки XX при дифференцировке экспрессируют только лишь одну аллель Xist, тогда как клетки XY никогда не инициируют экспрессию.