Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

2. Эпигенетическая регуляция репликации ДНК, репарации и теломер

Первым этапом в обеспечении наследования генетической информации является надежная дупликация всего генома, которая осуществляется процессом, известным как репликация ДНК. К сожалению, в ходе репликации происходят ошибки, вызывая изменения в ДНК (мутации), которые могут быть вредными для жизнеспособности организма. Кроме того, такие агенты внешней среды, как радиация, производят мутации, в том числе изменения оснований в ДНК, делеции, инсерции (вставки) и перестройки. Клетки реагируют на повреждение ДНК активацией механизмов репарации ДНК, выполняющих удивительную работу по поддержанию надежности и стабильности генома. Наконец, дупликация линейных молекул ДНК ставит задачи, которые решаются наличием специализированных последовательностей и структур на концах хромосомы, известных как теломеры. Недавние исследования показали, что на эти базовые процессы, необходимые для точного удвоения и поддержания нуклеотидных последовательностей ДНК, влияют эпигенетические механизмы, регулирующие хроматин.

2.1. Инициация репликации ДНК контролируется эпигенетическими механизмами

Надежное копирование ДНК осуществляется ДНК-полимеразами, действующими от 5’- к З’-концу, и начинается в специфических сайтах, называемых «ориджинами» [точками начала репликации ДНК]. В «ориджинах» образуется «пузырь», состоящий из двухрепликационных «вилок», и репликация идет в двух направлениях, пока не встречаются «вилки», генерируемые следующими «ориджинами». Домены, реплицируемые с одного «ориджина», обычно очень большие, длиной в сотни тысяч пар оснований (Aladjem and Fanning, 2004). «Ориджины» у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (известные также как ARSs — autonomously replicating sequences, автономно реплицирующиеся последовательности) функционируют эктопически, будучи клонированы в плазмиды, и обычно после интеграции в другие хромосомные сайты, показывая тем самым, что инициация репликации регулируется специфическими последовательностями нуклеотидов ДНК. ARSs имеют величину приблизительно 100—150 п.н. и содержат одну или несколько копий важной последовательности длиной приблизительно 11 п.н. и обогащенной АТ плюс другие консервативные элементы (Weireich et al., 2004). Для инициации необходим белковый комплекс, известный как комплекс распознавания «ориджинов» (ORC, origin recognition complex), который отвечает за рекрутирование предрепликационного комплекса (PRC, prereplication complex), включающего белки поддержания минихромосом (МСМ, minichromosome maintenance proteins) (Prasanth et al., 2004). У многоклеточных «ориджины» репликации можно идентифицировать in situ, но обычно после клонирования и реинтродукции они не активны, что позволяет предполагать, что у этих организмов инициация регулируется эпигенетически, а не строгой зависимостью от последовательности ДНК (Aladjem and Fanning, 2004). Хотя у многоклеточных белки ORC и МСМ консервативны, факторы и механизмы, ответственные за регуляцию активности «ориджинов» у этих организмов, остаются загадкой. Кроме того, неясно, влияет ли структура хроматина на работу репликационных «вилок».

Ключ к тому, каким образом «ориджины» многоклеточных могли бы регулироваться эпигенетически, дают детальные исследования на S. cerevisiae. Хотя нуклеотидные последовательности ДНК в «ориджинах» необходимы и, по большей части, достаточны для инициации репликации у этого организма, имеются четкие данные о влиянии структуры хроматина на активность «ориджинов» (Weinreich et al., 2004). Анализ с использованием микрочипов (microarray analysis) показал, что не все из 332 сайтов двунаправленной репликации или из 429 сайтов связывания белков ORC и МСМ активны в каждом клеточном цикле. Хромосомный контекст и структура хроматина влияют на способность предполагаемого «ориджина» быть активным в инициации репликации. Например, ARS, локализованная в «молчащих» локусах типа спаривания, не может инициировать репликацию, если не будет перемещена в другие места хромосомы. Другой пример эпигенетической регуляции «ориджинов» относится к приблизительно 100—200 генам, кодирующим рибосомную РНК (rDNA), которые расположены в виде тандемных повторов (Pasero et al., 2002). Каждая единица rDNA длиной 9.1 т.п.н. содержит ARS, которая инициирует репликацию, будучи вставлена в плазмиду или в другое место генома. Однако в каждой S-фазе активны лишь около 20 % «ориджинов» rDNA.

«Ориджины» могут также регулироваться таким образом, что будут работать [to fire] на разных стадиях S-фазы (Weinreich et al., 2004). Например, «ориджины» возле теломер обычно активны в поздней S-фазе (см. раздел 2.3 далее в этой главе), но вставка тех же самых последовательностей в кольцевые плазмиды приводит к репликации в ранней S-фазе (рис. 14.3) (Ferguson and Fangman, 1992) Поздняя репликация может рекапитулировать в результате линеаризации такой плазмиды и добавления теломер, что помещает ARSs вблизи концов.

Рис. 14.3. Эпигенетическая регуляция сроков репликации у дрожжей

^{Один из лучших примеров эпигенетических влияний на репликации был продемонстрирован у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вставка поздно реплицирующегося «ориджина» в кольцевую плазмиду приводит к ранней репликации в S-фазе, а поздняя репликация восстанавливается после линеаризации этой плазмиды и добавления теломер (Ferguson and Fangman, 1992; Weinreich et al., 2004)}

Эти результаты показывают, что как активность «ориджинов», так и время начала работы «ориджина» в ходе S-фазы регулируются эпигенетически. Дальнейшие доказательства вытекают из наблюдений, согласно которым «расписание» S-фазы, сайленсинг «ориджинов» в rDNA, теломеры и локусы типа спаривания регулируются многими из модификаций гистонов и белками, отвечающими за эпигенетический сайленсинг генов, в том числе белками SIR (глава 4).

2.2. Репарация ДНК включает эпигенетические изменения в структуре хроматина

Накопление повреждений ДНК из-за ошибок репликации или воздействия внешними агентами может приводить к вредным мутациям, нестабильности генома, раку, старению клеток и смерти. Повреждения ДНК исправляются механизмами исправления ошибок в ходе репликации ДНК, а также независимыми механизмами, действующими в фазе G_r Клетки содержат «контрольные точки» («checkpoints»), выявляющие наличие повреждений ДНК и останавливающие или задерживающие клеточный цикл до тех пор, пока не завершится репарация; эти механизмы индуцируют также гибель клетки (апоптоз), если повреждение не исправляется, что способствует выживаемости организма за счет удаления дефектных клеток. Эти процессы в норме весьма эффективны; например, клетки кожи человека, подвергнутые УФ-облучению солнечного света, содержат удивительно большое количество повреждений ДНК, подавляющее большинство которых должным образом вылечиваются (Friedberg et al., 1995). Индивидуумы, дефектные по репарации в силу мутаций в одном или нескольких компонентах механизмов «контрольной точки» или репарации, страдают от целого ряда заболеваний, в том числе предрасположенностью к раку прямой кишки, груди и кожи и подвержены преждевременному старению.

В ранних исследованиях были успешно идентифицированы молекулы и механизмы, распознающие разные типы повреждений в ДНК, такие как двунитевые разрывы (DSBs) и пиримидиновые димеры, и рекрутирующие специфические комплексы для исправления этих повреждений. Однако упаковка ДНК в хроматин могла бы потенциально блокировать доступ факторов, участвующих в распознавании сайтов повреждения или осуществляющих репарцию, подобно репрессивному влиянию гетерохроматина на экспрессию генов (Hassa and Hottiger, 2005). Однако репарация использует АТФ-зависимые комплексы ремоделинга хроматина, которые, как предполагается, «экспонируют» дефектную ДНК для репарации

Более недавние исследования показали, что специфические изменения в хроматиновой матрице, такие как присутствие вариантов гистонов и посттрансляционные модификации гистонов, играют ключевую роль в распознавании повреждений ДНК и в рекрутировании соответствующих механизмов репарации (Hassa and Hottiger, 2005). Например, присутствие DSBs имеет своим результатом быстрое фосфорилирование варианта гистона Н2А, Н2АХ, по серинам 136 и 139 (обозначается у ШАХ). Фосфорилирование Н2АХ необходимо для накопления белков репарации в больших (мегабазы) районах, окружающих DBSs, и для сборки «фокусов» репарации, а не для первоначального рекрутирования репарационных комплексов к первичным сайтам повреждения ДНК (Bassing et al., 2002; Celeste et al., 2002). Эти наблюдения позволяют предполагать, что «распространение» у ШАХ из DBSs действует для усиления сигнала, исходящего из DBSs, увеличивая рекрутирование и, возможно, сохранение факторов репарации (Fernandez-Capetillo et al., 2004). В дополнение к участию в репарации DBSs фосфорилирование Н2АХ влияет на рекомбинацию V(D)J в лимфоцитах млекопитающих, а также действует как супрессор геномной нестабильности и опухолей у мышей (Fernandez-Capetillo et al., 2004).

Другие типы изменений хроматина, такие как ацетилирование гистонов, SUMOhjiирование, убиквитинирование и метилирование, также играют заметную роль в успешной репарации ДНК. Например, метилирование гистона H3 по лизину 79 (H3K79me) необходимо для рекрутирования к DSBs белка репарационной «контрольной точки» 53ВР1 и опосредуется DOT1-метилтрансферазой лизинов гистонов (НКМТ) (Huyen et al., 2004). Интересно, что индуцированные повреждения ДНК не изменяют уровни метилирования H3K79, позволяя предполагать, что эта модификация не добавляется в ответ на DSBs. Одна из возможностей заключается в том, что рекрутирование 53ВР1 и «ощущение» («sensing») DSBs связано с экспозицией предсуществующего метилирования H3K79 в ответ на ремоделинг хроматина в сайтах повреждений ДНК.

Хотя наше современное понимание влияния этих и других факторов хроматина на репарацию ДНК предполагает участие в сигналинге и рекрутировании соответствующих комплексов к повреждениям ДНК, вполне вероятно, что будущие исследования выявят новые направления, по которым эпигенетические механизмы регулируют пути, поддерживающие стабильность генома. Важно отметить, что роль хроматина в репарации ДНК является динамической и происходит в ответ на повреждение. Хотя модификации гистонов и другие эпигенетические регуляторные белки играют ключевые роли, эти изменения не наследуются при клеточном делении, в отличие от других примеров, обсуждаемых в этой главе.

2.3. Эпигенетический контроль структуры и функции теломер

Концы линейных эукариотических хромосом являются специализированными сайтами, известными как теломеры; они выполняют три существенные функции. Во-первых, теломеры обеспечивают включение самых дистальных концов хромосом в репликацию ДНК, решая тем самым «проблему репликации концов» (Lue, 2004). Во-вторых, теломеры защищают концы хромосом от деградации и подавляют слияния с другими хромосомами. В-третьих, у многих, но не у всех, организмов теломеры облегчают спаривание хромосом в мейозе. У большинства эукариот теломеры состоят из простых, коротких повторов, которые восстанавливаются ферментом теломеразой. Теломерные функции регулируются как механизмами на основе нуклеотидных последовательностей, так и эпигенетическими механизмами.

Проблема репликации концов возникает в связи с тем, что ДНК-полимеразе требуется праймер для инициации синтеза в направлении 5’ к 3’ «отстающей нити»; следствием этой ограниченной активности фермента оказывается тот факт, что репликация не может проходить до самого конца хромосомы (Lue, 2004). Для преодоления этой проблемы используются два механизма. Преобладающий механизм, используемый большинством организмов, в том числе дрожжами, млекопитающими и растениями, включает необычный ферментативный комплекс, известный как теломераза. Теломеры у большинства эукариот состоят из простых повторов длиной 6 п.н., распространяющихся на расстояние от десятков до сотен тысяч пар оснований. Теломеразные комплексы содержат энзиматическую активность, подобную обратной транскриптазе, а также РНК, обладающими гомологией с теломерными повторами. Суть дела состоит в том, что репликация конца выполняется путем «нацеливания» этого комплекса на теломерные повторы с помощью РНК-компонента; за этим следует обратная транскрипция (3’ к 5’), производящая новые повторы. Интересно, что утрата теломеразной активности и укороченные теломеры коррелируют с клеточным дряхлением и старением и, наоборот, раковые клетки обнаруживают повышенную теломеразную активность и удлиненные теломеры (Blasco, 2005).

Существуют также независящие от теломеразы механизмы поддержания хромосомных концов (Louis and Vershinin, 2005). Одна хорошо изученная альтернативная система, по-видимому, ограничена дрозофилой и другими двукрылыми. У этих организмов теломераза не идентифицируется, а концы не содержат простых, коротких повторов, обнаруживаемых у большинства других эукариот. Вместо этого концы хромосом Drosophila состоят из перетасованныхкластеровразличныхретротранспозонов типа non-LTR (LTR — длинный терминальный повтор), размеры которых варьируют от 3 до 5 т.п.н., и других повторов (TAS — telomere-associated repeats) (Biessmann and mason, 2003). Эти транспозоны кодируют ферменты типа обратной транскриптазы (отсюда re/rot ransposon), позволяя предполагать, что здесь имеется эволюционное родство с более стандартными теломеразными механизмами. Основное различие, однако, заключается в том, что хромосомы Drosophila не реплицируются до самого конца; они теряют примерно 70 п.н. на мушиное поколение, т.е. примерно то самое количество, которое ожидается в связи с проблемой репликации концов. Эта утрата не выбывает делеции существенных генов, потому что домены теломерных и субтеломерных повторов имеют длину около 50—100 т.п.н., и потребовалось бы много поколений, чтобы потерялось достаточное количество ДНК и были достигнуты участки с генами. Эта утеря теломерных последовательностей компенсируется, однако, нечастым добавлением ретротранспозонов типа non-LTR (Biessmann and Mason, 2003).

Эпигенетическая регуляция затрагивает функции теломер и экспрессию генов, находящихся в этом районе. «Голая» теломерная ДНК или внутренние DSBs приводят к хромосомным слияниям и анеуплоидии. Барбара МакКлинток (Barbara McClintock) первой описала явление, известное как цикл «разрыв-слияние-мостик». в котором слияния между разорванными хромосомами или слияния концов хромосом производят дицентрические хромосомы и анафазные мосты, которые генерируют дальнейшие разрывы. Доказательства эпигенетической регуляции теломерной защиты концов хромосом вытекает из исследований на Drosophila, показавших, что она не зависит от нуклеотидных последовательностей ДНК. Оторванный конец хромосомы у Drosophila может вести себя как DSB в одном поколении, но действует как полностью функциональная теломера впоследствии, без какого-либо добавления ретротранспозонов или каких-либо изменений последовательности (Ahmad and Golic, 1998). Более того, любой конец, созданный у Drosophila (известно как терминальные делеции), может быть упакован как теломера и защищен от событий слияния (Karpen and Spradling, 1992). Кроме того, у Schizosaccharomyces pombe теломерные функции зависят от белка Tazl (Miller and Cooper, 2003) и теломерного хроматина, и эта зависимость не связана с каноническими теломерными повторами (Sadaie et al., 2003).

Теломерные районы содержат модификации хроматина и обладают свойствами, сходными с перицентромерным гетерохроматином, описанным в разделе 3 далее в этой главе. Характеристика эпигенетических механизмов, регулирующих теломерные и субтеломерные районы, была получена в исследованиях экспрессии генов у дрожжей и Drosophila, но наблюдается также у человека. Сайленсинг эухроматиновых генов, вставленных в теломерные районы, варьирует. Это явление называется теломерным эффектом положения (ТРЕ, telomere position effect); оно похоже на эффект положения мозаичного типа (PEV, position-effect variegation), индуцируемый соседним центромерным гетерохроматином у мух и S. pombe (детали см. в главах 5 и 6, соответственно). У почкующихся дрожжей многие факторы, связанные с хроматином, такие как белки SIR, влияющие на сайленсинг типа спаривания, влияют также на сайленсинг, индуцируемый теломерой (глава 4). Удивительно, что почти ни один из генов, регулирующих PEV у Drosophila (Супрессоры и Энхансеры Мозаицизма, Su(var) s и E(var)s, описанные в главе 5), никак не влияет на теломерный сайленсинг. Это заставляет предположить, что PEV и ТРЕ опосредованы, по крайней мере отчасти, разными механизмами (Cryderman et al., 1999; Donaldson et al., 2002).

Гетерохроматиновый белок 1 (HP1, продукт гена Su(var)) и метилирвание H3K9, которые являются ключевыми компонентами сайленсинга, опосредованного хроматином (глава 8), присутствуют в теломерах Drosophila и необходимы для удлинения теломер (рис. 14.4) (Perrini et al., 2004). Результатом делеции НР1 или его партнера по связыванию НОАР (сокращение для НР1/ ORC-associated protein) оказывается очень высокая частота теломерных слияний (Cenci et al., 2003). НР1 обычно рекрутируется к хроматину благодаря своему сродству к метилированному H3K9 через хромодомен. Интересно, что кэпирование теломеры белком НР1 не зависит от метилирования H3K9; это позволяет предполагать, что защита концов опосредуется альтернативным механизмом, в котором участвует прямое связывание с теломерной ДНК или нетеломерными последовательностями, присутствующими в терминальных делециях (рис. 14.4а) (Perrini et al., 2004). Одна из привлекательных моделей сводится к тому, что НР1 связывается и защищает концы независимо от нуклеотидной последовательности ДНК, затем рекрутирует неизвестную НКМТ H3K9; локальное метилирование H3K9 могло бы затем рекрутировать к этому участку большие количества НР1, что стимулирует распространение теломерного сайленсинга (рис. 14.4). Этот механизм, вероятно, не требует средств RNAi, участвующих в установлении и сайленсинге центромерного гетерохроматина (глава 8), но этот компонент модели нуждается в прямой проверке.

Недавние исследования показали, что у млекопитающих зависимое от теломеразы удлинение теломеры также регулируется эпигенетически (Lai et al., 2005). Например, мыши с делецией обеих копий HKMTs H3K9. Suvar39hl/2, имеют теломеры с редуцированными уровнями H3K9me2 и H3K9me3 и демонстрируют аномально длинные теломеры (рис. 14.46) (Garcia-Cao et al., 2004). Эти результаты позволяют предполагать, что активность НКМТ Suvar39hl/2 превращает модификацию H3K9me в ди- и триметилированные формы, облегчая связывание гомологов НР1, СЬх 3 и 5, которые необходимы для сборки нормальной структуры теломерного хроматина и регуляции длины теломер.

Наконец, эпигенетические модификации, происходящие в теломерах, влияют также и на мейотическую рекомбинацию и передачу хромосом. Например, у почкующихся дрожжей утрата Ndjl, теломерного белка, необходимого как для формирования теломерного букета (т.е. образования кластера), так и для мейотической рекомбинации (Wu and Burgess, 2006), приводит к резкой редукции частоты теломерных делеций (Joseph et al., 2005). Джозеф и сотрудники предполагают что Ndj 1 облегчает теломерную делецию, «стимулируя взаимодействия теломер в ходе мейоза, что приводит к эффективному увеличению содержания факторов, необходимых для делеции». Аналогичным образом, мутанты, дефектные по транскрипционному сайленсингу генов, помещенных поблизости от теломер, демонстрируют серьезные нарушения в мейотическом спаривании и рекомбинации, что приводит к неправильной агрегации во время мейоза (Nimmo et al., 1998). Таким образом, эпигенетические события, которые контролируют как длину теломер, так и транскрипционную компетентность, используются также в процессах, контролирующих поведение хромосом в ходе мейоза.

3. Эпигенетическая регуляция идентичности и функции центромер

Для нормального наследования генетического материала требуется, чтобы после того как геном точно дуплицировался и репарировался в S-фазе, хромосомы надежно расходились во время митоза и мейоза. Центромеры были впервые определены в 1880 году Флемингом (Flemming) как цитологически видимая «первичная» перетяжка в хромосоме. В начале 1900-х годов центромеры были определены и генетически как хромосомные сайты, существенные для нормального наследования, и как участки с резко сниженной или даже вовсе отсутствующей мейотической рекомбинацией. В настоящее время мы определяем центромеру (CEN) как ДНК плюс белки хроматина, ответственные за формирование кинетохора. Кинетохор — это белковая структура, облегчающая прикрепление микротрубочек и движение вдоль них, обращенная к пластинке во время прометафазы и к полюсам во время анафазы митоза и мейоза. Кинетохор служит также местом действия ключевой для клеточного цикла «контрольной точки», известной как «контрольная точка сборки веретена» (SAC, spindle assembly checkpoint), или «митотическая контрольная точка» (Cleveland et al., 2003).

Рис. 14.4. У мух и млекопитающих функции теломер регулируются эпигенетически

^{(а) У Drosophila гетерохроматиновый белок 1 (НР1) связывается с теломерной ДНК независимо от ее хромодомена и «кэпирует» теломеры, что обеспечивает нормальное расхождение благодаря блокировке теломерных слияний (Fanti et al. 1998; Perrini et al. 2004). Затем HP1 рекрутирует неизвестную метилтрансферазу гистонов (НКМТ; не Su(var)3-9), которая триметилирует H3K9 на близлежащих нуклеосомах; НР1 связывается с H3K9me3 через хромодомен, что, в свою очередь, рекрутирует большие количества НКМТ, а последовательные раунды связывания НР1 — рекрутирования НКМТ стимулируют распространение «молчащего» хроматина по субтеломерным районам, (б) У мышей нокаут обоих локусов НКМТ Suv39 понижает уровни H3K9me3 и me2 и увеличивает содержание модификаций H3K9me, измененной структуры хроматина и изменений в уровнях белков, связывающихся с ди- и триметилированными H3K9 (1 СЬх 3 и 5), H3K9me (Т Cbx 1) и TERF 1 и 2 (не показано) в теломерах (Garcia-Cao et al. 2004). Эти изменения коррелируют с увеличенной длиной теломер, позволяя предполагать, чтотриметилирование H3K9 с помощью Suv39hs необходимо для нормального функционирования теломеразы и регуляции размера теломер}