Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

^{(а) Ножные имагинальные диски, окрашенные антителами против белка, кодируемого геном Нох, Scr, который специфицирует идентичность лабиального и первого торакального сегментов, в том числе первой пары ног. (б) Базитарзальные сегменты ног взрослых особей дикого типа и мутантных. Обратите внимание на присутствие зубцов полового гребешка на ноге первой, но не второй и третей пары у взрослых особей дикого типа. Ген Scr частично дерепрессирован во вторых и третьих ножных дисках, где в норме он «молчит», у особей, гетерозиготных по мутациям в генах PcG, что приводит к появлению эктопических зубцов полового гребешка на ногах второй и третьей пары. Эти фенотипы супрессируются мутациями в brm и многих других генах trxG (а — перепечатано, с любезного разрешения, из Tamkun et al., 1992 [©Elsevier]; б — часть с изменениями, с любезного разрешения, из Kennison, 2003 [©Elsevier].)}

Рак и другие заболевания человека могут быть результатом неспособности поддерживать наследуемое состояние экспрессии генов. Неудивительно, что многие гены PcG и trxG у человека функционируют как протоонкогены или гены-супрессоры опухолей. Например, ген MLL из группы trxG у человека первоначально был идентифицирован по хромосомным транслокациям 1 lq23, ассоциированным с острой лимфобластозной (ALL) или миелоидной (AML) лейкемией. Мутации в других генах trxG млекопитающих также ассоциируются с различными раковыми заболеваниями (дополнительные детали см. в главе 23). Например, BRG1, аналог гена brm Drosophila у человека, физически взаимодействует с белком-супрессором опухоли ретинобластомы; нарушение этого взаимодействия приводит к ускоренному клеточному делению и злокачественной трансформации в некоторых линиях опухолевых клеток человека (Dunaief et al, 1994; Strober et al., 1996). В согласии с ролью BRG1 в супрессии опухоли мыши, гетерозиготные по мутациям в этом гене, склонны к образованию разнообразных опухолей (Bultman et al., 2000). Мутации в INI 1, человеческом аналоге гена группы trxG SNF5-related gene 1 (SNR1) у Drosophila, также делают их носителей предрасположенными к раку и были идентифицированы в большом проценте злокачественных рабдоидных опухолей (агрессивный рак у детей) (Versteege et al., 1998). Эти и другие связи с заболеваниями у человека дали исследователям дополнительную мотивацию к пониманию механизма действия белков trxG.

1.3. Белки trxG играют разные роли в эукариотической транскрипции

Группа активаторов trxG — это большая и функционально разнообразная группа регуляторных белков. Это может отражать сложность эукариотической транскрипции, включающей высокорегулируемые взаимодействия между геноспецифичными активаторами транскрипции, многочисленными компонентами общей транскрипционной машины и транскрибируемой матрицей ДНК Активация транскрипции включает связывание сиквенс-специфичных активирующих белков, рекрутирование этими белками общей транскрипционной машины, формирование преинициационного комплекса, в котором РНК-полимераза II связывается с промотором, раскрытие спирали ДНК возле этого промотора, эффективный уход РНК-полимеразы от промотора и эффективную элонгацию РНК-полимеразы через данный ген.

Способность поддерживать состояние активной транскрипции могло бы включать любой из многочисленных этапов, необходимых для активации, поскольку на любом данном гене разные этапы могли бы играть роль, определяющую скорость процесса для транскрипционной активности. Упаковка эукариотической ДНК в хроматин представляет еще один уровень, на котором белки trxG могут регулировать транскрипцию Нуклеосомы и другие компоненты хроматина обнаруживают тенденцию к подавлению связывания общих и ген-специфичных транскрипционных факторов с ДНК, а также к подавлению элонгации РНК-полимеразы. Изменения в структуре хроматина — в том числе изменения в структуре и позиционировании нуклеосом — могут влиять практически на каждый этап в процессе транскрипции.

Любой белок, необходимый для транскрипции, требуется для поддержания активного состояния. Действительно, некоторые белки trxG могут играть сравнительно общие роли в транскрипции, а не быть предназначенными исключительно для поддержания детерминированного состояния. Однако другие белки trxG могут играть специализированные роли в этом процессе, либо непосредственно противодействуя репрессии, осуществляемой PcG, либо поддерживая наследуемые состояния активности генов в ходе репликации ДНК и митоза. Этот последний класс белков trxG представляет особый интерес для биологии развития.

2. Связи между белками trxG и хроматином

Генетические исследования, показывающие, что гены trxG играют ключевые роли в транскрипции и развитии, стимулировали значительные усилия, направленные на понимание биохимической функции их продуктов. Многие из этих экспериментов использовали в качестве своей концептуальной базы гипотезу, согласно которой хроматин является биологически релевантным субстратом для белков trxG. Все гены упакованы в хроматин, и эта упаковка может создать компактное и недоступное состояние или же может находиться в открытом и пермиссивном состоянии. И пермиссивное, и недоступное состояния, по-видимому, могут быть наследуемыми. Эти соображения привели к простой гипотезе, согласно которой белки trxG могли бы модулировать структуру хроматина и влиять на регуляцию. Более того, поскольку гены trxG были клонированы и секвенированы, стало очевидным, что некоторые из их продуктов родственны белкам, участвующим в АТФ-зависимом ремоделинге хроматина или ковалентной модификации нуклеосомных гистонов у других организмов, в том числе у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Таким образом, хотя у дрожжей отсутствуют гены НОХ или репрессоры PcG, этот организм дал ценные сведения о потенциальной роли белков trxG в эукариотической транскрипции.

Одна из первых связей между trxG и хроматином вытекала из открытия, показавшего, что trxG-ген brm у Drosophila является близкородственным SWI2/SNF2 дрожжей (Tamkun et al., 1992). SWI2/SNF2 был идентифицирован в ходе скрининга на гены, участвующие в переключении типа спаривания (гены switch [xw/]) и сбраживании сахарозы (гены sucrose-nonfermenting [snf]). Впоследствии было показано, что SWI2/SNF2 необходим для активации многочисленных индуцибельных генов дрожжей (Holstegeetal., 1998; Sudarsanametal., 2000). Дефекты транскрипции, наблюдаемые у мутантов swi2/ snf2, супрессируются мутациями в нуклеосомных гистонах; это раннее наблюдение впервые позволило предположить, что SWI2/SNF2 активирует транскрипцию путем противодействия репрессии хроматина (Kruger et al., 1995). Биохимические исследования, проведенные в начале 1990-х годов, подтвердили эту гипотезу; SWI2/ SNF2 и многие другие белки, идентифицированные в ходе скрининга на swi2/snf2, функционируют как субъединицы большого белкового комплекса (SWI/SNF), использующего энергию гидролиза АТФ для увеличения способности белков связываться с нуклеосомной ДНК (Cote et al., 1994; Imbalzano et al., 1994; Kwon et al., 1994). SWI2/SNF2 функционирует как субъединица АТФазы, или «двигатель», этой машины ремоделинга хроматина; другие субъединицы комплекса SWI/SNF опосредуют взаимодействия с регуляторными белками или с его хроматиновым субстратом (Phelan et al., 1999).

На еще одну связь между trxG и хроматином указывало наличие доменов SET в белках Trithorax (TRX) и Absent (малый, или гомеотический — ASH1) группы trxG. Домен SET был первоначально определен по отрезку аминокислотной последовательности, обнаруживающему гомологию между Su(var)3-9, Enhancer of zeste (E(z)) и TRX; последние два белка являются членами PcG и trxG, соответственно. В конце 1990-х годов было показано, что белки семейства SET обладают активностью НКМТ. Su(var)3-9 метилирует H3K9, тогда как (E(z)) метилирует H3K27 (Rea et al., 2000; Levine et al., 2004; Ringrose and paro, 2004) Как обсуждается в других главах, метилирование H3K9 стимулирует сборку гетерохроматина, тогда как метилирование H3K27 оказывается необходимым для PcG-репрессии (более детальное обсуждение см. в главах 5 и 11, соответственно). Присутствие доменов SET в белках trxG позволило предположить, что метилирование «хвостов» гистонов могло бы иметь важное значение для поддержания активных транскрипционных состояний.

Эти открытия, вместе с растущим пониманием, что ферменты ремоделинга и модификации хроматина играют ключевую роль в активации транскрипции, побудили биохимиков идентифицировать белковые комплексы, содержащие белки trxG, и изучить влияние этих комплексов на структуру хроматина in vitro. Другие эксперименты имели своей целью проверку гипотезы о том, что белки trxG могли бы взаимодействовать непосредственно с транскрипционной машиной (еще один хорошо установленный способ влиять на регуляцию) Как описано ниже, эти исследования показали, что некоторые белки trxG влияют на регуляцию посредством модификации структуры хроматина, тогда как другие функционируют путем прямых взаимодействий с компонентами транскрипционной машины.

2.1. Белки trxG, участвующие в АТФ-зависимом ремоделировании хроматина

Участие комплексов ремоделинга хроматина предполагалось в самых разных биологических процессах, в том числе в репрессии и активации транскрипции, сборке хроматина, регуляции структуры хроматина более высокого порядка и в клеточной дифференцировке. Наиболее всесторонне изученными белками trxG, участвующими в ремоделинге хроматина, являются BRM и его аналоги у человека, BRG1 и HBRM. Как и предсказывалось, эти белки функционируют как АТФазные субъединицы комплексов, очень близко родственных SWI/SNF дрожжей (Kwon et al., 1994; Wang et al., 1996). Комплексы SWI/SNF сотержат от 8 до 15 субъединиц и были очень консервативны в ходе эволюции (рис. 12.5). АТФаза каждого из этих комплексов способна функционировать как отдельная субъединица. Хотя на это семейство белков исторически ссылались как на содержащее «геликазный» мотив (в силу сходства их АТФазного домена с доменом истинных геликаз), никогда не было показано, что эти белки, родственные BRM, обладают геликазной активностью; скорее, для влияния на изменения в структуре хроматина они используют другие механизмы, такие как транслокацию вдоль ДНК (Whitehouse et al., 2003; Saha et al., 2005). Второй trxG-ген, идентифицированный при этом скрининге, moira (тог), кодирует еще один ключевой член этого АТФ-зависимого ремоделирующего комплекса у Drosophila, а гомологи BRM и MOR взаимодействуют непосредственно и формируют функциональный кор SWI/ SNF у человека (Phelan et al., 1999).

SWI/SNF и другие комплексы ремоделинга хроматина используют энергию гидролиза АТФ для изменения структуры или позиционирования нуклеосом. Катализируя АТФ-зависимые изменения в структуре хроматина, комплексы ремоделинга хроматина помогают транскрипционным факторам и другим регуляторным белкам получить доступ к нуклеотидным последовательностям ДНК, которые в норме были бы закрыты гистоновыми белками (Polach and Widom, 1995; Logie and Peterson, 1997). Среди моделей создания доступа к специфическим сайтам — «скольжение» гистонов по ДНК для перемещения сайта в линкерный участок, выпетливание ДНК из гистонового октамера или же (самый крайний вариант!) выселение всего гистонового октамера в другое место в ядре (рис. 12.6). АТФ-зависимый ремоделинг может также приводить к изменениям в положении нуклеосом вдоль нуклеотидной последовательности ДНК, к изменениям в спейсинге нуклеосом и к перемещениям гистонов в гистоновый октамер (являющийся кором нуклеосомы) и из него. Другие ремоделирующие комплексы обнаруживают разную склонность к выполнению каждой из этих функций.

Puc. 12.5. Семейство ремоделирующих комплексов SWI/SNF

^{Каждый комплекс содержит член SNF2/SWI2-семейства АТФаз и по крайней мере восемь других субъединиц, (а) Схематическое изображение белка BRM, показывающее расположение АТФазного домена и карбокситерминального бромодомена (обнаруживающего сродство к ацетилированным остаткам лизина в гистоновых «хвостах»), которые консервативны у всех членов семейства SNF2/SWI2. Показаны цветом комплексы SWI/SNF у дрожжей (б), Drosophila (в) и человека (г). Дальнейшую информацию об этих комплексах и их субъединицах можно найти в Mohrmann and Verrijzer. 2005}

б Обмен гистонов

Рис. 12.6. Механизмы АТФ-зависимого ремоделинга

^{Модели ремоделирования хроматина иллюстрируются показом изменения в положении или составе нуклеосом относительно ДНК, обернутой вокруг них. Центральная часть рисунка показывает стартовый район хроматина, где линкерная ДНК изображена желтым цветом, а нуклеосомная ДНК — красным, (а) Движение нуклеосомы трансляционно вдоль ДНК (скольжение) для открытия участка (отмеченного красным цветом), который ранее был закрыт; (б) обмен стандартного гистона на вариантный гистон для создания вариантной нуклеосомы; (в) вытеснение нуклеосом для открытия большого района ДНК. Этот механизм мог бы зависеть от других белков, таких как гистоновые шапероны или факторы, связывающиеся с ДНК, в дополнение к белкам ремоделлинга; (г) создание петли на поверхности нуклеосомы. Гипотетически предполагается, что ремоделеры семейства SWI/ SNF используют альтернативные механизмы, такие как создание стабильных петель ДНК на поверхности нуклеосомы, чтобы сделать доступными сайты, являющиеся центральными для этой нуклеосомы}

У высших эукариот комплексы SWI/SNF весьма многочисленны; например, каждое ядро млекопитающих содержит около 25 ООО копий комплексов семейства SWI/SNF. Биохимические анализы показывают, что комплексы SWI/SNF способны открывать доступ к необычно широкому спектру сайтов в нуклеосоме по сравнению с другими АТФ-зависимыми комплексами ремоделинга хроматина (Fan et al., 2003). Например, комплексы SWI/SNF способны эффективно обеспечивать доступ к сайтам в центре мононуклеосомы, что в энергетическом отношении затруднительно, поскольку сайты в центре нуклеосомы имеют приблизительно 70 пар оснований ограниченной [constrained] нуклеосомной ДНК с каждой стороны. Вызывается ли это необычно мощной способностью использовать энергию гидролиза АТФ по сравнению с другими ремоделерами или же, вместо этого, представляет другой механизм ремоделинга, является темой текущих исследований (Kassabov et al., 2003). Комплексы SWI/SNF не обнаруживают сколько-нибудь измеримой способности равномерно распределять [to space] нуклеосомы, что является отличительным признаком других комплексов ремоделинга хроматина. Они также не обнаруживают такой же степени эффективности в «свопинге» [swapping — обмен одних элементов на другие] димеров Н2А/ Н2В, как некоторые другие комплексы ремоделинга хроматина, хотя при тестировании in vitro они способны осуществлять это и перемещать октамеры (Lorch et al., 1999). Какая из этих способностей имеет отношение к функции этих комплексов в поддержании активного состояния, еще не ясно.

У каждого исследованного вида предполагалось участие комплексов SWI/SNF в транскрипционной активации. Это семейство комплексов может быть «нацелено» на гены взаимодействиями с транскрипционными активаторами, может ремоделировать нуклеосомы, помогая в первоначальном связывании общих транскрипционных факторов и РНК-полимеразы II, и может становиться «нацеленным» на более поздних стадиях процесса активации, способствуя транскрипционной элонгации. Таким образом, комплексы SW1/SNF, по-видимому, функционируют на каждом этапе процесса транскрипционной активации, хотя, по-видимому, имеет место акцент на функцию, осуществляемую на ранних этапах, ведущих к загрузке РНК-полимеразы II. Анализ с использованием микрочипов (microarray analysis) у дрожжей показывает, что помимо этих влияний, стимулирующих активацию, комплексы SWI/SNF могут также облегчать репрессию некоторых генов (Sudarsanam et al., 2000).

Одна простая гипотеза, объясняющая эти широкие функции in vivo, заключается в том, что эти ремоделирующие комплексы изменяют структуру нуклеосом таким образом, что облегчается связывание и функционирование широкого спектра разных регуляторных факторов и комплексов. Таким образом, эффективные [potent] характеристики ремоделинга, наблюдаемые in vitro, могли бы отражать способность существенно расширять доступ к регуляторным факторам in vivo. Возможно, что комплексы SWI/SNF обладают уникальной способностью создавать широкий доступ, которая может объяснять их важное значение в поддержании активного состояния.

Каждый изученный вид обладает по крайней мере двумя разными комплексами SWI/SNF, которые оба содержат BRM или близкородственную АТФазу ремоделинга хроматина. Еще один белок trxG, OSA, обеспечивает различие между этими комплексами в том отношении, что один класс комплексов содержит OS А, а еще один эволюционно консервативный комплекс содержит белок с полибромодоменом (рис. 12.6) (Mohrmann and Verrijzer, 2005). Биохимическая функция OSA не ясна. Одна привлекательная возможность заключается в том, что он мог бы «нацеливать» комплекс SWI/SNF, в котором он находится, на специфическую группу генов.

SWI/SNF — не единственный фактор ремоделинга хроматина, имеющийся в эукариотических клетках. Идентифицированы десятки различных комплексов реиоделинга хроматина, в том числе NURF, NURD, ACF и CHRAC (Vignali et al., 2000). Эти комплексы можно подразделить на несколько основных групп на основе идентичностей их АТФазных субъединиц. Комплексы SWI/SNF содержат АТФазы, родственные SWI2/SNF2; комплексы ISWI (например, NURF, CHRAC и ACF) содержат АТФазы, родственные Imitation-SWI (ISWI); наконец, комплексы CHD (например, NURD) содержат АТФазы, родственные CHD1 и Mi2.

Недавние исследования позволили предположить участие имеющегося у Drosophila kismet (kis) — члена семейства CHD факторов ремоделинга хроматина — в поддержании активного состояния. Подобно brm, mor и osa, kis был идентифицирован в ходе скрининга на экстрагенные супрессоры Рс; это позволяло предполагать, что он действует антагонистически по отношению к белкам PcG и поддерживает активные состояния НОХ-транскрипции (Kennison and Tamkun, 1988). Генетические исследования показали, что kis необходим как для сегментации, так и для поддержания HOX-транскрипции в ходе развития Drosophila (Daubresse et al., 1999; Therrien et al., 2000). Консервативные домены вне АТФазного домена (в том числе бромодомены и хромодомены) вносят свой вклад в функциональную специфичность ремоделирующих хроматин факторов, опосредуя взаимодействия с нуклеосомами или другими белками. BRM и другие АТФазные субъединицы комплексов SW1/SNF содержат единственный бромодомен (белковый мотив, ассоциированный со связыванием определенных ацетилированных гистонов), тогда как KIS-L содержит два хромодомена (белковых мотива, связывающихся с определенными метилированными гистонами) и является, следовательно, более похожим на Mi2 и другие ремоделирующие хроматин факторы, члены семейства CDH. Хотя большие размеры KIS-L (~575 кДа) затруднили биохимический анализ этого белка, его последовательность убедительно свидетельствует о том, что он активирует транскрипцию, ремоделируя хроматин

KIS-L не ассоциирован физически с BRM и хроматографически ведет себя так, как будто бы он находится в другом белковом комплексе (Srinivasan et al., 2005). Однако эти два белка существенно перекрываются друг с другом и с РНК-полимеразой II на политенных хромосомах, что позволяет предполагать, что оба они играют относительно глобальные роли в транскрипции (рис. 12.7) (Armstrong et al., 2002; Srinivasan et al., 2005). Утрата функции BRM блокирует относительно ранний этап в транскрипции (Armstrong et al., 2002), тогда как утрата функции KIS-L ведет к снижению уровня элонгации, но не инициации форм РНК-полимеразы II (Srinivasan et al., 2005). Эти открытия заставляют предполагать, что BRM и KIS-L облегчают различные этапы в транскрипции с помощью РНК-полимеразы II, катализируя АТФ-зависимые изменения в структуре или спейсинге нуклеосом.