Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

4. обнаружения важной роли PTGS в защите от вирусов, это связано с разными вирусными белками, подавляющими разными способами замалчивание генов;

5. обнаружения таких процессов, как не клеточноавтономный сайленсинг и транзитивность (раздел 3.2, подраздел «Не клеточно-автономный сайленсинг и транзитивность»), которые обусловлены РНК-зависимыми РНК-полимеразами, шесть из которых закодированы в геноме Arabidopsis.

Все это обсуждается при рассмотрении трех основных путей РНК-направляемого замалчивания генов у растений (рис. 9.3а-в). Следует иметь в виду, что эти пути взаимно перекрещиваются друг с другом. Их функционально различные компоненты приведены в табл. 9.2.

3.2. Путь 1: связанное с трансгенами посттранскрипционное и индуцированное вирусами замалчивание генов (PTGS/VICS)

Направляемое PHKi замалчивание генов, индуцированное трансгенами и вирусами, изначально функционировало как защитная система хозяина от чужих и инвазивных нуклеиновых кислот в виде соответствующих вирусных компонентов, транспозонов и трансгенов.

Рис. 9.3. Пути РНК-обусловленного сайленсинга у растений

^{Несмотря на то, что отдельные элементы и пути сайленсинга могут перекрываться или быть общими, все же различают три основных пути сайленсинга, они отличаются по источникам двутяжевых РНК, классу маленьких РНК, природе мишеней-последовательностей и характеру сайленсинга. На рисунке эффекторные комплексы сайленсинга, содержащие белки аргонавты, показаны в виде светлосерых шариков. Желтыми прямоугольниками помечены процессы, протекающие в ядре. Детали и названия регуляторных элементов описаны в тексте и табл. 9.2. Специфические растительные белки отмечены зеленым. PTGS — посттранскрипционное замалчивание генов, VIGS — индуцированное вирусом замалчивание генов, TGS — транскрипционное замалчивание генов, RdDM — направляемое РНК метилирование ДНК, IR — инвертированные повторы, AS — антисенс, антисмысловая последовательность, vRdRP — вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза, аРНК — аберрантная РНК, siPHK — короткая интерферирующая РНК, RISC — РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (взято с изменениями из работы Meins et al., 2005)}

Трансгенные конструкции можно ввести в растительный геном в смысловой или антисмысловой ориентации или в виде инвертированных повторяющихся последовательностей ДНК. Вирусы могут иметь геномы, представленные одно- или двутяжевыми ДНК или РНК. Поэтому dsPHK могут возникать разными путями. В принципе антисмысловые транскрипты могут комплементарно спариваться с информационными РНК-мишенями с образованием двутяжевых РНК. Транскрипция инвертированных повторов ДНК может приводить к образованию шпилечных РНК. Вирусные РНК, кодирующие собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу (vRdRP) и реплицирующиеся с образованием двутяжевых интермедиатов РНК, включаются в игру прямо на уровне двутяжевых РНК. Наоборот, смысловые трансгены и ДНК-содержащие вирусы как, например, джеминивирусы, для образования двутяжевых РНК нуждаются в клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразе RDR6 и других генетически идентифицированных факторах (SDE3, SGS3 и WEX; табл. 9.2). При образовании субстратов для RDR6 транскрипты или смысловые трансгены и вирусные ДНК должны быть в известном смысле аберрантными, например, без 5’ cap или полиаденилатного хвоста (Meins et al., 2005).

Активность DCL, необходимая для процессирования dsPHK с образованием siPHK при PTGS, еще не идентифицирована (DCLX). Анализ dell мутантов с частично утраченными функциями показал, что DCL1, по-видимому, не вовлечен в эту стадию процессинга. Специфический растительный белок HEN 1 метилирует 3’-нуклеотид у маленьких РНК, защищая их от уридилирования и последующей деградации (Li et al., 2005). DCL2 участвует в образовании siPHK из некоторых, но не всех, вирусных РНК (Xie et al., 2004).

PTGS и VIGS приводят к образованию двух разных по величине и функциональному значению классов siPHK, состоящих из 21-22 нуклеотидов и 24-26 нуклеотидов, соответственно (Baulcombe, 2004). В целом, считается, что 21-членные siPHKs участвуют в растеплении иРНК, а 24-26-членные, называемые гетерохроматиновыми siPHK, вызывают эпигенетические модификации в гомологичных последовательностях ДНК (TGS; см. раздел 3.4).

Вслед за осуществленным DCL процессингом дуплекс siPHK раскручивается и антисмысловая цепочка взаимодействует с одним из белков из семейства аргонавтов с образованием комплекса индуцированного РНК сайлесинга (RISC). RISC, запрограммированный siPHK, может затем эндонуклеолитически гидролизовать мРНК-мишени в одном единственном месте примерно в середине комплементарного комплекса siPHK-мРНК. У животных это расщепление катализируется Ago2 «slicer» (см. главу 8). У Arabidopsis эту функцию в трансгенном PTGS выполняет белок AGOl (Baumberger and Baulcombe, 2005). Вслед за нуклеолитическим расщеплением отдельный 3’-фрагмент мРНК деградируется в направлении от 5’ к 3’ концу экзонуклеазой AtXRN4 (Souret et al., 2004), а 5’-фрагмент, по-видимому, гидролизуется экзосомой в направлении от 3’- к 5’-концу.

PTGS у растений обладает двумя особенностями, которые обусловлены активностью РНК-зависимой РНК-полимеразы RDR6: не клеточно-автономным сайленсингом и транзитивностью (рис. 9.3а). В первом случае индуцирующие PTGS сигнальные РНК перемещаются из клеток, в которых они возникли, в соседние через плазмодесмы или, как это изначально было показано в опытах с прививками, по сосудистой системе и вызывают специфичное к нуклеотидной последовательности замалчивание генов в довольно отдаленных местах (Voinnet, 2005). Небольшие мобильные РНК, являющиеся системными сигналами замалчивания генов, могли бы выполнять двойственную функцию в развитии растения: осуществлять коммуникацию между клетками и координировать их активность в разных, в том числе и отдаленных частях растения. Это предположение подкреплено открытием микроРНК (miPHK; важны для развития, раздел 3.3) и небольшого связывающего Маленькие РНК белка в соке флоэмы, который служит основным транспортером метаболитов по сосудистой системе растения (Yoo et al., 2004).

Транзитивность представляет собой образование вторичных siPHK, соответствующих определенным нуклеотидным последовательностям, локализованным вне первичных мишеней. В этом случае РНК-зависимая РНК-полимераза катализирует синтез вторичных двутяжевых РНК на трансгенных или вирусных матричных РНК с использованием в качестве праймеров первичных siPHK. В результате действия дайсера образуются вторичные siPHK, которые преумножают реакцию сайленсинга и, когда речь идет о вирусных РНК, увеличивают устойчивость растений к вирусной инфекции (\binnet, 2005).

Другим единственным организмом, у которого выявлены не клеточно-автономное замалчивание генов и транзитивность. является нематода С. elegans (глава 8), имеющая предполагаемую РНК-зависимую РНК-полимеразу, которой нет у млекопитающих и Drosophila

Растительные вирусы — не только индукторы и мишени замалчивания генов, у них есть белки, которые могут подавлять сайленсинг (Voinnet, 2005). Это укрепляет идею о том, что PTGS служит природной защитой от вирусов, эти супрессорные белки стоят на вооружении контрзащитной «стратегии» патогена. В геноме большинства вирусов закодирован, по-крайней мере, один белок, подавляющий замалчивание генов, который работает на определенном этапе PTGS после процессинга двутяжевых РНК. Подавление PTGS вирусом четко наблюдается у крапчатой сои, у которой темная окраска есть результат обратимости естественного PTGS, т.е. реактивации гена, отвечающего за образование пигмента (рис. 9.2д) (Senda et al., 2004). Вирусные супрессоры PHKi недавно найдены также у вирусов насекомых и животных ретровирусов (Lecellier et al., 2005; Voinnet, 2005).

3.3 Путь 2: регуляция развития растений miPHK и транс-действующими siPHK

Открытие эндогенных популяций miPHK у растении и животных знаменовало новую эру в исследовании биологии развития и обусловленного PHKi замалчивания генов (Bartel, 2004). miPHK замалчивают экспрессию генов путем комплементарного спаривания с информационными РНК-мишенями и индукции расщепления мРНК или ингибирования трансляции. На важную роль miPHK в развитии растений указывает и тот факт, что многие необходимые для биогенеза miPHK и сайленсинга гены (в том числе DCL1, AGOl, HEN1, HYL1 и HST) были обнаружены при скринировании мутантов с дефектами развития, у них и было выявлено накопление miPHK. Фенотипы мутантов, дефектных по этим белкам, указывали на разнообразную роль miPHK в функционировании меристемы, полярности органов, развитии сосудистой системы, структуре цветка и ответах растения на стресс и гормональное воздействие (Kidner and Martienssen, 2005). Недавно установлено, что miPHK участвуют в биогенезе новых типов маленьких РНК и транс-действующих siPHK.

МикроРНК изначально были получены при клонировании разделенных по размеру маленьких РНК, содержащих 18-28 нуклеотидных остатков. Их высокая степень комплементарности к мРНК-мишеням у растений заметно облегчила идентификацию дополнительных микроРНК при компьютерном анализе. Таким путем у арабидопсиса найдены 92 локуса. в которых закодировано 27 определенных микроРНК, примерно столько же выявлено и у риса. Экспрессия многих микроРНК регулируется средой и программой развития растения. Примерно 50% их мишеней у арабидопсиса — факторы транскрипции, многие из которых являются модуляторами образования меристемы и идентичности. Это было установлено еще до их идентификации в качестве мишеней микроРНК. В отличие от этого, у животных микроРНК не всегда адресованы мишеням, кодирующим факторы транскрипции, а регулируют разные гены в клетке. Два важных белка микроРНКового пути у арабидопсиса, DCL1 и AGOl, саморегурегулируются с помощью микроРНК с участием негативной модуляции по принципу обратной связи (Kidnerand Martienssen, 2005).

У эукариот многие микроРНК эволюционно консервативны (Axtell and Bartel, 2005). Примечательно, что у цветковых, голосеменных и более примитивных растений мРНК группы факторов транскрипции, регулирующих образование меристемы и асимметрию латеральных органов, сохранили совершенную комплементарность к узнающим их микроРНК. Эта особенность сохранена по-крайней мере в течение 400 миллионов лет (Floyd and Bowman, 2004).

МикроРНК закодированы в таких зонах генома, которые расположены между генами, кодирующими белки, или в интронах. Они возникают из несовершенных шпилечных предшественников РНК размером от 70 до 300 и более пар оснований, которые транскрибируются ДНК-зависимой РНК-полимеразой II. Процессинг предшественников растительных микроРНК в ядре происходит в несколько этапов. Сначала концы пре-микроРНК удаляются ядерной DCL1. Для этого необходим связывающийся с двутяжевыми РНК белок HYL1, который был выделен при анализе фенотипических мутантов с дефектным гормональным ответом (Han et al., 2004; Vasquez et al., 2004a). Затем микроРНК дуплекс (miR/miR*, рис. 9.36) высвобождается под действием DCL1 и его 3’-конец метилируется с помощью HEN 1 (раздел 3.2, подраздел «Происхождение и процессинг двутяжевых РНК»). Для транспорта дуплекса miR/miR* из ядра в цитоплазму нужен HASTY (HST), гомолог животного экспортина 5 (Park et al., 2005). Зрелые микроРНК найдены также и в ядерной фракции, может быть в ядре некоторые из них могут осуществлять эпигенетические модификации. МикроРНК к сплайсированным растущим цепям транскриптов транскрипционных факторов индуцируют неким неизвестным путем цитозиновое метилирование ДНК в последовательностях, расположенных ниже гена-мишени (Schubert et al., 2005).

Биогенез микроРНК у животных происходит иначе, у них есть только один дайсер, который локализован в цитоплазме, и вторая РНК-аза III-типа, Drosha, в ядре. Drosha вместе со связывающим двутяжевые РНК белком Pasha (у растений их гомологов нет) отщепляет концы от пре-микроРНК. Затем такие пре-микроРНК перемещаются в цитоплазму экспортином 5 и процессируются окончательно дайсером с образованием зрелых микроРНК (Du and Zamore, 2005, Ют, 2005).

В целом, животные микроРНК неполностью комплементарны к мРНК-мишеням, и они подавляют трансляцию, связываясь с многими сайтами в 3’-нетранслируемых областях (UTR). В отличие от этого почти совершенная комплементарность растительных микроРНК к кодирующим участкам мРНК-мишеней способствует расщеплению мРНК, по-видимому, подобно siPHK. Однако существуют исключения из этих «правил». Так, например, растительная miR172 способна блокировать трансляцию, а некоторые животные микроРНК могут участвовать в расщеплении мРНК-мишеней (Du and Zamore, 2005).

AGO I — главный белок из семейства белков аргонавтов и нарезающий (слайсер) мРНК компонент в программированном микроРНК RISC у арабидопсиса (Baumberger and Baulcombe, 2005). AGOl был найден еще до открытия микроРНК при скрининге мутантов Arabidopsis с дефектным развитием листьев (Carmell et al., 2002). Название аргонавты было инспирировано фенотипом agol мутантов, которые были похожи на небольших кальмаров из-за их узких нитевидных листьев. У agol мутантов в апикальной меристеме побегов обнаруживаются такие же дефекты, как у дефектных мутантов PNH/ZLL/AGO10 (табл. 9.2), они сходны с AGOl, но еще неизвестно, нужны ли они для PTGS (Vaucheret et al., 2004). В меристемах растений белки AGO играют существенную роль в поддержании «стволовости» клеток (Carmell et al., 2002: Kidner and Martienssen, 2005).

Эндогенные транс-действующие siPHK (ta-siPHK) — новый тип маленьких РНК, которые недавно были открыты у Arabidopsis. ta-siPHK, гидролизующие свои мРНК-мишени, обладают свойствами как siPHK, так и микроРНК. Подобно siPHK синтез двутяжевых РНК-предшественников ta-siPHKs зависит от RDR6 и SGS3. Как и микроРН К, ta-siPHК образуются в таких участках генома, которые мало сходны с их мРНК-мишенями. Для образования правильных ta-siPHK, комплементарных мРНК-мишеням, микроРНК настраивает фазовое расщепление предшественников двутяжевых РНК с помощью DCL4 (рис. 9.36) (Allen et al., 2005; Gasciolli et al., 2005).

ta-siPHK приписывают регуляторную роль в определении времени развития растения. Побег цветкового растения во время развития проходит две фазы перемен: вегетативную фазу с переходом от молодого в зрелое состояние побега и репродуктивную фазу, которая сопровождается ростом цветочных ветвей вместо вегетативных (рис. 9.1). В то время как индукция цветения изучена генетически довольно хорошо, вегетативная фаза перемен в побеге исследована гораздо хуже. Один из белков аргонавтов, ZIPPY/AG07, играет специализированную роль в таком фазовом переходе. При скрининге мутантов с преждевременными изменениями в вегетативной фазе развития побега, аналогичных zip, ago7 мутантам, были выявлены два гена (RDR6и SGS3), которые важны для PTGS (рис. 9.36) (Peregrine et al., 2004). Последующий анализ показал, что некоторые гены с контролируемой увеличенной экспрессией у rdrb и sgs3 мутантов замалчиваются посттранскрипционно с помощью ta-siPHK (Vazquez et al., 2004b). Эти данные свидетельствуют о том, что компоненты PTGS важны не только для защиты растения от вирусов и замалчивания трансгенов, но также и для контроля за временем включения пусковых механизмов развития растения. Пока еще не известно, есть ли у животных такие ta-siPHK.

3.4. Путь 3: связанный с трансгенами транскрипционный сайленсинг, направляемое РНК метилирование ДНК и образование гетерохроматина

Современные концепции обусловленного PHKi транскрипционного замалчивания генов выросли из более ранних исследований гомологичного замалчивания генов, запускаемого множественными копиями промоторных областей генома, и из результатов изучения направляемого РНК метилирования ДНК (Matzke and Matzke, 2004). Последующее изучение PHKi-зависимого образования гетерохроматина у делящихся дрожжей (главы 6 и 8) и индуцированных siPHK TGS в клетках млекопитающих заметно расширили представления о филогенетических масштабах этих процессов и подтвердили их перекрывание с PHKi.

Впервые RdDM наблюдали у растений табака, зараженных вироидами (Wassenegger et al., 1994). Вироиды — небольшие патогены растений, содержащие только некодирующие белки циклические РНК, состоящие из нескольких сотен нуклеотидных остатков. В изначальных экспериментах было обнаружено, что реплицирующиеся вироиды запускают de novo метилирование вироидных кДНК, интегрированных в геном табака в качестве трансгенов. При изучении таких трансгенных систем было установлено, что для RdDM необходимы двутяжевые РНК, которые процессируются с возникновением маленьких РНК (признак PHKi). Реплицирующиеся исключительно в цитоплазме РНК-содержащие вирусы индуцируют метилирование гомологичных участков в ядерной ДНК. Это указывало на то, что маленькие РНК, возникающие при PTGS, способны проникать в ядро и индуцировать в нем эпигенетические изменения. Содержащие промоторные последовательности двутяжевые РНК могут направлять метилирование ДНК и вызывать транскрипционное замалчивание узнаваемых ими промоторов-мишеней (Mathieu and Bender, 2004: Matzke et al., 2005).

У растений РНК индуцируют специфическое de novo метилирование цитозиновых остатков в разных нуклеотидных последовательностях ДНК преимущественно в областях комплементарного взаимодействия. Считается, что в результате этого специфического спаривания РНК с ДНК возникает субстрат для de novo метилирования ДНК, однако это еще требует экспериментальных доказательств. В то время как асимметричное CpNpN метилирование не поддерживается после удаления триггерной РНК, симметричные CpG и CpNpG метилирования сохраняются без РНК в области разных промоторов. Различия в эффективности поддерживающих метилирований ДНК могут быть связаны с разным составом нуклеотидных последовательностей или разным характером модификаций гистонов.