Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

^г Dnmt2 (Рр) и MBD-доменные белки (Се. СЬ, Рр). ^д Dnmt2 (Рр) и MBD-доменные белки.

Другая определенная отличительная черта растений — менее четко очерченная зародышевая линия и ее отделение от соматических клеток только на поздней стадии развития (рис. 9.1). У растений в точках роста на кончиках побегов и корней имеются апикальные меристемы, из которых образуются новые ткани и органы. Апикальная меристема побега дает начало цветкам, которые образуют гаметы для полового размножения, могут вырастать и дополнителные латеральные меристемы и образовывать цветы. У многих растений появились специализированные органы — ризомы, клубни или луковицы, которые имеют меристемы. Эти механизмы вегетативного размножения могут быть даже более общими и эффективными, чем размножение семенами. Зародыши могут образоваться не только в результате развития оплодотворенной яйцеклетки, но и из соматической ткани (соматический эмбриогенез). В тканевой культуре некоторые дифференцированные соматические клетки могут дедифференцироваться и перепрограммироваться в сторону альтернативной дифференцировки. Поэтому соматическое клонирование, пока еще мало эффективное у животных, широко распространено у многих видов растений, и с годами могут быть воспроизведены бесчисленные «зеленые Долли». Однако у клонированных казалось бы генетически униформных популяций растений набюдается выраженная фенотипическая изменчивость. Эта так называемая «сомаклональная вариабельность» имеет четкую эпигенетическую основу и потенциально может быть использована в селекции и адаптации растений (см. обзор Kaeppler et al., 2000)

Рис. 9.1. Особенности жизненного цикла растения

^{Растения могут размножаться половым путем (образование гамет, оплодотворение и образование семян (правая часть рисунка) и бесполым (соматическим) путем (вегетативное размножение, де- и редифференцировка или эмбриогенез (левая часть рисунка). Тело высшего растения (корни, стебель, цветок) — диплоидный спорофит. При мейозе число хромосом уменьшается вдвое. Если у животных продукты мейоза образуют гаметы без дальнейшего деления и они сливаются с образованием диплоидного ядра, то у растений образуются гаплоидные мужской или женский гаметофиты в результате двух или трех митотических делений, соответственно. В конечном итоге пыльцевая трубка содержит одно вегетативное (белое) и два генеративных (черные) ядра. Два генеративных ядра оплодотворяют яйцеклетку (черная) и формируется центральная клетка с диплоидным ядром, произошедшим в результате слияния двух полярных ядер (желтые) Таким образом, в результате этого двойного оплодотворения и образуются диплоидный зародыш и триплоидный эндосперм, который снабжает развивающийся зародыш питанием. После прорастания семени зародыш дает начало новому спорофиту. Кроме того, большинство растений способны размножаться вегетативно благодаря активации покоящихся латеральных меристем, выросту специализированных корневых структур (клубни), амплификации в тканевых культурах или даже регенерации из индивидуальных соматических клеток после удаления клеточной стенки (протопласты). У растений часто наблюдается эндоредупликация, которая приводит к образованию полиплоидных клеток или тканей Химерные растения можно получить с помощью прививки. Поэтому генетическая и эпигенетическая информация у растений проходит гораздо меньше четко определенных путей развития зародышевой линии, чем у животных}

Еще одна отличительная черта растений — существование плазмодесм (цитоплазматические мостики между клетками), которые проницаемы для небольших молекул, некоторых белков, РНК и вирусной геномной информации. Несмотря на большую взаимосвязанность, побеги растений можно срезать и привить на генетически отличные подвои (рис. 9.1). Это приведет к образованию химер, у которых вегетативные и генеративные ткани генетически различны. Поэтому хотя эпигенетические признаки и передаются по зародышевой линии, у растений они более изменчивы и обратимы, чем у животных.

Растения более толерантны к полиплоидии (умножение полного хромосомного набора), чем животные. У растений встречается множество диких и культурных полиплоидных видов (пшеница, хлопчатник, картофель, арахис, сахарный тростник, табак и другие). Полиплоидность дает им некоторые преимущества. При исследовании нуклеотидных последовательностей многих растительных геномов, включая маленький геном Arabidopsis thaliana, получены четкие доказательства дупликации исходного генома и генов. Даже диплоидные растения могут иметь полиплоидные клетки, которые возникают гораздо чаще, чем некоторые высокоспециализированные полиплоидные клетки у млекопитающих. Образование полиплоидов часто связано со значительными генетическими и эпигенетическими изменениями (см. обзор Adams and Wendel, 2005). Некоторые из этих изменений могут произойти на протяжении одного или нескольких поколений и они важны для быстрой адаптации и эволюции растений.

1.3. Растения лучше выносят некоторые методологические манипуляции, которые очень трудно применимы к млекопитающим

У животных генетические манипуляции ограничены из-за процедур, требующих генерацию мутаций и спаривание для получения гомозиготных генотипов, которые обязательны для проявления рецессивных признаков. Напротив, у растений возможен эффективный мутагенез путем химических или физических обработок или в основном с помощью хаотичных вставок помеченных трансгенов или транспозируемых элементов. Вследствие самоопыления

в последующем поколении легко появляются потомки с гомозиготными мутациями растения и расщеплением признаков по закону Менделя. Поиск мутаций в эпигенетических регуляторах основан на восстановлении экспрессии у эпигенетически инактивированных маркерных генов или снижении активности стабильно активных репортерных генов. В дополнение к такой прямой объективной методологии, быстро растущие коллекции инсерционных мутантов с определенными сайтами интеграции позволяют осуществлять обратный генетический анализ мутационных эффектов в избранных определенных генах-ортологах эпигенетических регуляторов у других модельных организмов (табл. 9.2).

Рис. 9.2. Изучение эпигенетического контроля у растений

^{Гены, кодирующие окраску тканей у растений, позволяют довольно просто и недорого анализировать экспрессию генов in vivo (а) Экспрессия гена дигидрофлавонолредуктазы (DFR) отвечает за темнопурпурную окраску цветков петунии, а при замалчивании промотора этого гена цветки становятся пестрыми, светлоокрашенными (любезно предоставлено Kooter) (б) У Arabidopsis с экспрессией гена (CHS) халконсинтетазы семена имеют темную оболочку, а после замалчивания этого гена в результате интеграции гомологичного трансгена они становятся желтыми (любезно предоставлено lan Fumer). (в) Растения кукурузы с В-1 геном имеют пурпурную пигментацию, а растения с парамутагенным инактивированным В’ геном зеленые, (г) Початок кукурузы с сегрегированной вставкой транспозона (Spm) в гене В-Peru, необходимом для образования антоцианового пигмента. Пурпурные зерна представляют собой ревертанты, у которых в гене зародышевой линии вырезан Spm элемент. Сильно пятнистые зерновки содержат активный Spm элемент, который часто индуцирует соматическое вырезание соответствующих секторов при созревании зерновки. Зерна с редкими небольшими пурпурными участками представляют собой зерновки, у которых Spm элемент эпигенетически зарепрессирован (любезно предоставлено Vicky Chandler), (д) Темная окраска соевых бобов (в середине рисунка) уменьшается у культивируемых разновидностей сои (слева) в результате природного посттранскрипционного сайленсинга CHS гена, она может частично восстанавливаться при заражении родительского растения вирусом с PTGS супрессорным белком, обусловливающим пеструю окраску (справа), (е) Эпигенетическая регуляция может отражаться и в морфологии растений: сниженное функционирование субъединицы фактора сборки хроматина приводит к образованию «сросшегося» стебля у Arabidopsis, (ж) реактивация (снятие сайленсинга) трансгенного маркера устойчивости у Arabidopsis может быть выявлена по росту растения на селективной среде (с, перепечатано с разрешения Chandler et al., 2000 [Springer Science and Business Media]; д перепечатано с разрешения Senda etal., 2004 [©American Society of Plant Biologists].)}

Число членов в семействе гомологичных генов может быть весьма различным у животных и растений. Вследствие функциональной избыточности некоторые мутации могут быть не столь серьезны как у животных, так и у растений. Это важно, если потеря функции сопровождается утратой индивидуума до анализа в раннем развитии. Экспрессию относительно мало значимых генов, например, отвечающих за окраску растительных тканей, можно просто и недорого выявлять in vivo (рис. 9.2а—д). К тому же тысячи растений могут быть проанализированы в селекционных опытах путем выявления экспрессии эндогенных или трансгенных черт (рис. 9.2ж).

Знание нуклеотидной последовательности генома A. thaliana, наряду с анализом некоторых больших коллекций инсерционных мутантов, и простой мутагенез сделали это растение прекрасной моделью для изучения эпигенеза у растений. Последующие рассуждения касаются эпигенетических модификаторов, функции которых стали известны в результате анализа мутантов, дефектных по трансгенному сайленсингу (замалчиванию генов) и благодаря биоинформационной идентификации гомологии с генами, необходимыми для сайленсинга у других организмов, и обнаружению сходных фенотипов развития у других дефектных по сайленсингу мутантов Arabidopsis в результате прямого и обратного скрининга (табл. 2). Для ознакомления с полным перечнем хроматиновых генов Arabidopsis, риса и кукурузы читатель может быть адресован к Plant Chromatin Database (http://www.chromdb.org).

1.4. Исследование растений внесло самый значимый вклад в эпигенетику

Самый ощутимый вклад в эпигенетику при исследовании различных растительных моделей внесли сведения из семеноводства. Определенные данные о различии организации эу- и гетерохроматина были получены в результате цитологического анализа мхов (Heitz, 1928). Первым доказательством так называемой неменделевской генетики (см. обзор Chandler and Stam, 2004) было обнаружение наследуемой, но обратимой экспрессии генов при взаимодействии аллелей у томатов и кукурузы, позднее названной парамутацией; это же выявлено теперь и у млекопитающих. Постоянное появление у растений цветков с измененной симметрией («peloria» или монстры) описано еще Карлом Линнеем; сегодня это могло бы объясняться образованием эпиаллели — стабильной эпигенетической модификацией регуляторного гена с такой же нуклеотидной последовательностью, как и у экспрессируемого гена (Cubas et al., 1999). В результате цитологического анализа растений выявлены существенные изменения во вторичной организации хромосом, которые оказались связанными с ядрышковым доминированием, с замолканием одного из наборов родительских генов рибосомных РНК у межвидовых гибридов, что определяется эпигенетической регуляцией (Pikaard, 2000). Пионерские исследования лауреата Нобелевской премии Барбары МакКлинток и других ученых транспозиции генетических элементов у кукурузы выявили множественные связи между генетикой и эпигенетической регуляцией (Fedoroff and Chandler, 1994). На самом деле именно анализ теперешних транспозонов и их дегенерированных останков послужил основанием для выявления эпигенетических модификаций в растительных геномах (раздел 3.4).

Когда техника трансгеноза стала уже рутинной в конце 1980 годов, благодаря использованию генетических маркеров были неожиданно достигнуты значительные успехи в исследовании эпигенетики табака, петуньи и арабидопсиса (Jorgensen, 2003; Matzke and Matzke, 2004). Была сформулирована концепция гомологичного замалчивания генов, когда стало ясно, что замалчивание генов часто коррелирует с наличием множественных копий связанных или несвязанных трасгенов. Разные случаи гомологичного замолкания генов обусловлены либо усиленным обменом мРНК (посттранскрипционное замалчивание генов, ПЗГ, PTGS) или репрессией транскрипции (транскрипционное замалчивание генов, ТЗГ. TGS). Оба эти процесса коррелировали с увеличением цитозинового метилирования молчащих генов. Наиболее яркий пример ПЗГ у трансгенной петунии вначале был назван «косупрессией». Были осуществлены попытки изменить окраску цветков путем усиления экспрессии генов халконсинтазы (CHS), определяющих пурпурную окраску лепестков, от пестрой до почти полностью белой. Потеря окраски была обусловлена скоординированным замалчиванием CHS трансгена и эндогенного CHS гена (Jorgensen, 2003). ПЗГ связано с интерферирующими РНК (PHKi), которые позже выявлены у Caenorhabditis elegans и других организмов (раздел 3.2).

В середине 1990-х годов была выявлена связь между ПЗГ и устойчивостью к вирусам. ПЗГ оказалось природным механизмом защиты растений от несанкционированной репликации вирусов, которые могут быть как индукторами, так и мишенью для ПЗГ. Это было установлено в опытах по замалчиванию генов у растений путем использования специально сконструированных вирусных векторов с последовательностями, гомологичными генам-мишеням, что и приводило к индуцированному вирусом замалчиванию генов ((VIGS; Burch-Smith et al., 2004). Наряду с этим было открыто метилирование ДНК, направляемое РНК (RdDM) у зараженных вироидами растений. Это послужило первым указанием на то, что РНК, воздействуя на ДНК по принципу обратной связи, может вызывать эпигенетические модификации (Wassenegger et al., 1994). Этот принцип был успешно использован для транскрипционной инактивации и метилирования промоторов с помощью специальных двутяжевых РНК (раздел 3.4, Управляемое РНК метилирование ДНК).

2. Молекулярные компоненты хроматина у растений

Ранее мы уже упоминали многие компоненты систем эпигенетической регуляции у растений, которые были выявлены в результате анализа мутаций у арабидопсиса (табл. 9.2). Однако результаты скрининга мутантов могут выявлять не все эпигенетические модификаторы из-за функционального разнообразия больших семейств генов или летальных последствий утраты существенных генетических компонентов.

2.1. Регуляторы метилирования ДНК у растений

Метилирование 5-го углеродного остаткав цитозине ДНК— признак эпигенетической инактивации и гетерохроматина у растений и животных (табл. 18.1). Однако у растений метилирование ДНК имеет ряд уникальных черт в отношении характера (профиля) метилирования ДНК. ферментов ДНК-метилтрансфераз и возможности обратимости метилирования в неделящихся клетках (Chan et al., 2005). В этом разделе мы описываем белки, необходимые для генерации, поддержания, интепретации и «стирания» картины метилирования ДНК Специальные компоненты для PHК-направляемого метилирования ДНК представлены в разделе 3.4.

Различают de novo и поддерживающее метилирования ДНК De novo метилирование осуществляет модификацию прежде неметилированных последовательностей ДНК (рис. 18.1). У растений это метилирование может затрагивать CpG, CpNpG и CpNpN последовательности (где N - А, Т или С). В отличие от растений у животных метилирование ДНК, в основном ограничивается CpG динуклеотидами и пока нет сведений о существенном метилировании цитозиновых остатков в асимметричных CpNpN сайтах. Хотя природа сигналов, запускающих de novo метилирование ДНК, в основном пока еще неизвестна, однако у растений эту роль могут выполнять двутяжевые РНК (раздел 3.4). Поддерживающее метилирование сохраняет картину (pattern) метилирования генома при репликации ДНК и особенно эффективно затрагивает CpG и CpNpG нуклеотидные последовательности, обладающие палиндромной симметрией. Поддерживающему метилированию подвержены полуметилированные ДНК после репликации или репарации, у которых «гидом» для узнавания метилируемых сайтов в новообразованной цепи служат метилированные цитозиновые остатки в материнской цепи. Хотя считается, что у растений de novo и поддерживающее метилирования ДНК осуществляются разными ферментами, тем не менее, есть мнение и о том, что ферменты с различной сайтовой (CpG или не CpG) специфичностью могут часто делать то и другое.

У растений имеются три консервативных семейства ДНК-метилтрансфераз. Ферменты из семейства МЕТ1 ДНК-метилтрансфераз — гомологи животных ДНК-метилтрансфераз типа Dnmt1 (глава 18) в основном являются поддерживающими CpG метилирование ДНК ферментами, хотя одна из них участвует в de novo CpG метилировании при направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 3.4). Класс Dnmt2 ферментов, из которых один закодирован в геноме арабидопсиса, представлен семейством наиболее широко распространенных и высоко консервативных ДНК-метилтрансфераз (табл. 9.2), функция которых все еще не известна. Растительные DRM (domains rearranged methyltransferases) ДНК-метилтрансферазы и их гомологи ферментов (группа Dnmt3) млекопитающих обычно рассматриваются как de novo метилтрансферазы. Эти ферменты катализируют метилирование цитозиновых остатков во всех контекстах и участвуют в направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 4). Как это следует из названия, домены в этих ферментах реаранжированы: в отличие от Dnmt3 у DRM белков домены I-V следуют за доменами VI-X. Это может придавать этим ферментам способность метилировать асимметричные CpNpN нуклеотидные последовательности, которые в клетках млекопитающих не метилируются. Специфичная для растений хромометилаза СМТЗ модифицирует цитозиновый остаток в тринуклеотиде CpNpG. Подобно ферменту МЕТ1 эта метилтрансфераза участвует как в de novo, так и в поддерживающем метилировании ДНК. Истинная функция СМТЗ все еще не совсем ясна, хотя известно, что утрата ее активности у соответствующих мутантов сопровождается реактивацией некоторых молчащих транспозонов (Chan et al., 2005).

В отличие от млекопитающих, у которых dnmtl и dnmt3 мутанты погибают во время эмбрионального развития или сразу же после рождения животного, растительные мутанты met1, cmt3 и drm жизнеспособны и обычно даже фертильны. Такая жизненность дефектных по ДНК-метилтрансферазам растительных мутантов позволяет более экстенсивно анализировать роль таких мутаций во время развития и половой репродукции растений, что вообще невозможно сделать в отношении млекопитающих (Chan et al., 2005).

Эпигенетическая регуляция свидетельствует о том, что активное или неактивное состояния генов потенцильно обратимы. Метилирование ДНК разрешает такую обратимость, потому что оно может пассивно или активно утрачиваться. Пассивная утрата происходит, когда метилирование невозможно в течение нескольких раундов репликации. Напротив, активное деметилирование может протекать в неделящихся клетках при наличии соответствующих энзиматических активностей. Относительно недавние сведения из биохимии животных указывают на то, что активное деметилирование может осуществляться под действием ДНК-гликозилаз, которые обычно участвуют в эксцизионной репарации ДНК путем выстригания оснований (Kress et al., 2001). Интерес к этому механизму вспыхнул вновь после открытия у арабидопсиса Demeter (DME) и репрессора сайленсинга (ROS1), которые представляют собой крупные белки с ДНК-гликозилазными доменами. ROS1 ген был идентифицирован при скрининге мутаций, приводящих к эпигенетической down-регуляции и гирперметлированию стабильно экспрессируемого репортерного гена (Gong et al., 2002). ROS1 белок гидролизовал (никировал) метилированную, но не неметилированную ДНК, что совпадало с его ролью в удалении метилированных цитозиновых остатков из ДНК путем выстригания основания при эксцизионной репарации ДНК. ROS1 экспрессируется конститутивно и поэтому в принципе может участвовать в утрате метилированных оснований у ДНК в неделящихся клетках на всех этапах развития (Kapoor et al., 2005а). Напротив, DME активность выявлена только в женском гаметофите, где она активирует фактор импринтинга Medea (МЕА) в зависимости от активности ДНК-гликозилазного домена (Choi et al., 2002). CG метилтрансфераза MET1 является антагонистом DME. Это указывает на то, что DME белок на самом деле нужен для деметилирования CG динуклеотидов (Hsieh and Fisher, 2005). У Arabidopsis имеются еще два уникальных для растений неохарактеризованные пока представителя семейства DME/ROS1. Такая своеобразная экспансия генов этого семейства указывает на то, что обратимое замалчивание генов путем активного деметилирования ДНК важно для физиологии растений, для их развития или адаптации к условиям среды.