Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Vinnet O. 2005. Induction and suppression of RNA silencing: Insights from viral infections. Nat. Rev. Genet. 6: 206-220.

Wagner D. 2003. Chromatin regulation of plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 6: 20-28.

Wang X.J., Gaasterland T., and Chua N.H. 2005. Genome-wide prediction and identification of cis-natural antisense transcripts in Arabidopsis thaliana. Genome Biol. 6: R30.

Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., and Sanger H.L. 1994. RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell 76: 567-576.

Xie Z., Johansen L.K., Gustafson A.M., Kasschau K.D., Lellis A.D., Hibernian D., Jacobsen S.E., and Carrington J.C. 2004. Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol. 2: E104.

Yoo B.-C, Kragler P., Varkonyi-Gasic E., Haywood V., Archer-Evans S., Lee Y.M., Lough T.J., and Lucas W.J. 2004. A systemic small RNA signalling system in plants. Plant Cell 16: 1979-2000.

http://asrp.cgrb.oregonstate.edu Arabidopsis thaliana small RNA project

http://mpss.dbi.udel.edu MPSS (Massively parallel signature sequencing)

http://www.arabidopsis.org/abrc Arabidopsis Biological Resource Center Stocks

http://www.chromdb.org Plant Chromatin Database

Глава 10. Модификации хроматина и механизм их действия

Tony Kouzarides¹ и Shelley L. Berger²

1The Gurdon Institute, University of Cambridge, United Kingdom

2The Wistar Institute, Philadelphia, Pensylvania 19104

Общее резюме

Гистоны являются строительными блоками нуклеосом, образуя октамерную структуру, которая упаковывает ДНК у эукариот и формирует структуру, известную как хроматин Хроматин, однако, не является однородной структурой, и в последние годы произошел взрыв в наших знаниях о вариациях в структуре хроматина. Это, в свою очередь, углубило наше понимание механизмов, регулирующих геномные матричные процессы, в частности посттрансляционных модификаций гистоновых белков (центральная характеристика этого геномного регулирования). Действительно, существует большое число посттрансляционных модификаций гистонов (HPTMs, histone posttranslational modifications). Они разделяются на две группы. Во-первых, существуют малые химические группы, в том числе ацетилирование, фосфорилирование и метилирование. Во-вторых, имеются гораздо более крупные пептиды, в том числе убиквитинирование и сумоилирование.

Как представляют себе влияние HPTMs на регуляцию и функционирование генома? Обычно рассматриваются три механизма, и полезно держать эти механизмы в голове, поскольку в этой главе представлены обширная информация и данные по истории HPTMs. Во-первых, HPTMs могут каким-то образом влиять на структуру хроматина —например, предотвращая ключевые контакты, облегчающие образование определенных конформаций хроматина или структур более высокого порядка (что может рассматриваться как cw-модифицирующие эффекты). Напротив, два других механизма считаются действующими в trans-конфигурации. HPTMs могут разрушать связывание белков, которые ассоциируются с хроматином или гистонами. Или же HPTMs могут создавать измененные связывающие поверхности, которые притягивают определенные эффекторные белки. Этот третий механизм был охарактеризован наиболее детально, и такое рекрутирование белков определяется по отношению к его функциональным последствиям: так, оно может иметь активирующее или же репрессивное влияние на транскрипцию. Большое число обнаруженных HPTMs и их разнообразные комбинации привели к мысли, что HPTMs осуществляют регуляцию посредством комбинаторных паттернов, во временных последовательностях, и могут устанавливаться на коротких и длинных расстояниях. Эти разнообразные механизмы определяют разные функциональные результаты — одни из них временные, преходящие, другие стабильные и эпигенетически наследуемые.

В 1960-е годы Винсент Олфри (Vincent Allfrey) идентифицировал ацетилирование, метилирование и фосфорилирование гистонов, выделенных из многих эукариот. Гистоны были также первыми распознанными убиквитилированными белковыми субстратами. Тем не менее, хотя Олфри и наблюдал определенные корреляции между модификациями и источником транс-крипционно активного хроматина, генетические и функциональные доказательства в пользу роли HPTMs в регуляции генов были получены значительно позже. Действительно, многие исследователи, изучавшие биохимию и генетику регуляции генов в 1980-е и 1990-е годы, скептически относились к мысли, что HPTMs играют причинную роль в регуляции генов

1. Гистоны и ацетилирование играют регуляторную роль в транскрипции

Как показано в этой главе, гистоны подвержены многим разным посттрансляционным модификациям (PTMs), и со временем несомненно будут обнаружены новые, пока еще не известные HPTMs. Известные модификации можно классифицировать либо как малые химические группы, обсуждаемые в разделах 2—4 этой главы, либо как более крупные пептидные изменения в гистонах, что обсуждается в разделе 5 (табл. 10.1). Механизм, посредством которого HPTMs влияют на хроматиновую матрицу и родственные процессы, такие как транскрипция или репрессия генов, рассматриваются в контексте трех концептуальных моделей, изображенных на рис. 10.1. Модель 1 предполагает, что посттрансляционно модифицированные гистоны могут каким-то образом изменять струкутру хроматина. В модели 2 НРТМ может подавлять связывание некоего фактора с хроматиновой матрицей, тогда как модель 3 предполагает, что НРТМ создает сайт связывания для определенного белка (см. также раздел 5 главы 3).

Что, в историческом плане, изменило главенствующий взгляд, согласно которому хроматин является, в основном, материалом упаковки ДНК? Самые ранние

HPTMs разбиваются на две группы: группа 1 представляет модификации малыми химическими группами, а группа 2 включает более крупные химические модификации данные о том, что HPTMs регулируют активацию транскрипции и сайленсинг, были получены в экспериментах на Saccharomyces cerevisiae в конце 1980-х годов. Эти почкующиеся дрожжи являются весьма эффективной моделью для проведения генетических экспериментов (в области как прямой, так и обратной генетики) по выяснению значения гистонов. Причина этого в том, что, в отличие от высших эукариот, где имеются множественные копии каждого гистонового гена, с однокопийными гистоновыми генами дрожжей можно легко проводить генетические манипуляции. Например, на фоне удаления с помощью делеций всех гистоновых генов можно ввести копию каждого гена, закодированную в эписоме, несущей такой селективный маркер, как ген URA3, для сохранения этой эписомы. Вторую копию гистонов можно ввести на второй эписоме, несущей другой селективный маркер. В этой второй копии можно вызвать мутацию с помощью сайт-направленного мутагенеза, а затем можно вызвать утерю первой копии, копии дикого типа, из клетки, используя 5-FOA (5-фтороротовая кислота), делающую продукт гена URA3 токсичным для клетки. Конечным результатом будет присутствие в клетке единственной копии — измененной копии на второй эписоме, которая содержит любое число мутаций, подлежащих тестированию. У S. cerevisiae гистоновые гены расположены парами H3/ Н4 и Н2А/Н2В, и их транскрипция в большой степени скоординирована таким образом, что совпадает с фазой S. Каждая нуклеосома собирается из тетрамера H3/Н4 и двух димеров Н2А/Н2В; когда одна пара любой двойки оказывается недо- или сверхтранскрибированной, нуклеосомы оказываются обедненными. Это изменение дозы гистонов генетическими средствами явилось одним из первоначальных доказательств того, что структура хроматина играет ключевую роль в регулировании экспрессии. Один такой подход использовал «прямую» генетику, когда были отселектированы случайные мутации, которые приводили к инактивации гена-маркера (Clark-Adams et al., 1988). Оказалось, что эти мутации изменяют количество пар гистонов. При втором подходе использовали «обратную» генетику, когда направленное «истощение» гистоновых генов давало четкое доказательство того, что гистоны регулируют транскрипцию генов (Han and Grunstein, 1988). Следующий этап заключался в том, чтобы провести делецию только аминотерминальных «хвостов» гистонов (сайты локализации многих НРТМ) или выполнить мутации-замены сайтов ацетилирования в гистонах. Эти более тонкие «хирургические» изменения также вызывали уменьшение активации генов, позволяя предполагать, что ацетилирование необходимо для транскрипции генов (Durrin et al., 1991).

Рис. 10.1. Модели, показывающие, каким образом посттрансляционные модификации гистонов влияют на хроматиновую матрицу

^{Модель 1 предполагает, что изменения в структуре хроматина опосредуются cis-эффектами ковалентных модификаций гистонов, таких как ацетилирование или фосфорилирование гистонов. Модель 2 иллюстрирует подавляющее влияние НРТМ на связывание ассоциированного с хроматином фактора (CF) на примере фосфорилирования по H3S10, блокирующего связывание НР1 в метилированном H3K9. В модели 3 НР1М может обеспечивать специфичность связывания для ассоциированного с хроматином фактора Классическим примером является связывание НР1 через посредство его хромодомена с метилированным H3K9}

При других подходах исследовали, изменяются ли нуклеосомы естественным образом в ходе активации генов. Биохимические эксперименты показали, что нуклеосомы играют репрессивную роль в транскрипции на матрицах ДНК in vitro (Workman and Roeder, 1987), но вопрос о том, происходит ли то же самое in vivo, является спорным. Некоторые промоторы обладают нуклеосомами, расположенными естественным образом «вверх по течению» от сайтов начала транскрипции, и эти позиционированные нуклеосомы становятся измененными, когда ген активируется (Svaren et al., 1994; Shim et al., 1998). В случае PH05 изменение нуклеосом требовало активатора, показывая тем самым, что без транскрипции нуклеосомы не были изменены. Однако было неясно, является ли это изменение причиной или же следствием транскрипции. Чтобы выяснить это, делетировали ТАТА-бокс, отменяющий транскрипцию у дрожжей. Положение нуклеосом, тем не менее, изменилось, заставляя предположить, что это изменение нуклеосом предшествует транскрипции.

В совокупности подобные эксперименты убедительно свидетельствовали о том, что для активации транскрипции могут быть необходимы и репозиционирование нуклеосом, и ацетилирование специфических остатков в гистоновых «хвостах»

2. Ацетилирование и деацетилирование