Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Считается, что MBD белки с метил-ДНК связывающим доменом участвуют в трансдукции собственно характера метилирования ДНК в измененную транскрипционную активность. У млекопитающих MBD белки связываются с метилированной ДНК и рекрутируют деацетилазы гистонов для усиления сайленсинга транскрипции. Arabidopsis имеет 12 MBD-содержащих генов по сравнению с 11 генами у млекопитающих, пятью генами у Drosophila, двумя генами у С. elegans и с отсутствием их в геномах грибов (Hung and Shen, 2003). Несмотря на то, что еще мало известно о функциях MBD белков у Arabidopsis, тем не менее нокдаун с помощью PHKi одного из них, AtMBD 11, связан с плейотропными эффектами при развитии растений (Springer and Kaeppler, 2005). Ни один из MBD белков Arabidopsis не идентифицирован при генетическом скрининге, возможно из-за функциональной избыточности. Кроме того, несмотря на консерватизм аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз у растений и животных, MBD-содержащие белки у представителей этих двух царств дивергировали целиком вне метил-CG-связывающего домена. Тем самым, хотя животные и растения используют для создания и поддержания картины метилирования генома родственные ферменты, они могут иметь возникшие в эволюции разные пути интерпретации этих картин с помощью определенных MBD белков (Springer and Kaeppler, 2005).

Метилирующие ферменты нуждаются в активированных метильных группах обычно в виде S-аденозилметионина. Поэтому удивительно, как это ранее биохимические пути образования этого кофактора рассматривались вне связи с эпигенетической регуляцией. Только недавно выявлено, что мутация (hogl) гена арабидопсиса, кодирующего S-аденозил-Т-гомоцистеингидролазу, отвечает за определенные эпигенетические дефекты (Rocha et al., 2005).

2.2. Ферменты модификации гистонов

Подобно другим организмам (табл. 9.1), растения имеют ферменты, которые посттрансляционно модифицируют аминоконцевые хвосты гистонов, что предполагает существование гистонового кода (Loidl, 2004). У растений модифицирующие гистоны ферменты часто кодируются относительно большими семействами генов. Полезная информация о большинстве этих генов все еще очень мала. Существуют, по крайней мере, две известные модификации гистонов — ацетилирование/деацетилирование и метилирование.

Разнонаправленное действие гистоновых ацетилтрансфераз (HATs) и деацетилаз (HDACs) обеспечивает обратимость этой модификации гистонов, т.е. их эпигенетического маркирования. Такая обратимость модификаций часто усиливается и тем, что в дополнение к гипоацетилированию гистонов молчащие гены еще и метилированы по CpG сайтам, из которых метилированные остатки цитозина потенциально могут быть удалены под действием ДНК-гликозилаз (раздел 2.1, подраздел «Активное CG деметилирование и ДНК-гликозилазы»). У Arabidopsis имеется 18 предполагаемых HDACs и 12 предполагаемых HATs (Pandey et al., 2002). Это больше, чем у других нерастительных эукариот; примерно такое же количество таких ферментов выявлено у млекопитающих. Эти ферменты консервативны у всех эукариот. У растений имеется одно из специфичных для них семейств белков, функциональная роль которых не известна. При генетическом скрининге обнаружены только два гена этого консервативного семейства: HDA1 и HDA6 (табл. 9.2). HDA6 участвует в поддерживающем CpG метилировании, индуцированном РНК, и модификации повторяющихся последовательностей, но почти не влияет на развитие. На это указывает нормальный фенотип у соответствующих дефектных мутантов. В отличие от этого сниженная экспрессия HDA1 сопровождается плейотропными эффектами при развитии. У Arabidopsis ни одна из HAT не найдена при генетическом скринировании, что могло бы указывать на функциональную их избыточность или участие в активации молчащих генов.

Белки, метилирующие лизиновые остатки в гистонах (упоминающиеся в этой книге как гистоновые лизин метилтрансферазы или HKMTs) и другие, содержат общий SET домен (SU(VAR)/E(Z)/TRX). Благодаря тому, что они обладают способностью метилировать гистон H3 или Н4 по разным лизиновым остаткам, различные комплексы белков с SET доменами играют заметную роль в промотировании или ингибировании транскрипции специфических генов и формировании гетерохроматина. Некоторые белки с SET доменом являются членами так называемых групп поликомб (PcG) и триторакс (trxG), они соответственно поддерживают транскрипционно неактивное или активное состояние гомеотических генов при развитии растений и животных (главы 11 и 12). Другие SET доменные белки, такие как SU(VAR)3-9, участвуют в поддержании конденсированного состояния гетерохроматина особенно часто в областях повторяющихся последовательностей ДНК путем метилирования гистона H3 по лизину 9 (H3K9). В геноме Arabidopsis закодировано 32 SET доменных белка, из которых экспрессируются 30. Они могут быть сгруппированы в виде четырех консервативных семейств: E(Z), TRX, ASH1 и SU(VAR)3-9; имеется также небольшое пятое семейство белков, которое выявлено только у дрожжей и растений (Baumbusch et al., 2001; Springer et al., 2003). Число экспрессируемых SET доменных белков у Arabidopsis относительно велико по сравнению с 14 белками у Drosophila и четырьмя белками у делящихся дрожжей. У мышей насчитывается 50 SET доменных белков. В дополнение к экспансии SET доменных белков в результате полиплоидии, у Arabidopsis существенную роль в амплификации членов группы SU(VAR)3-9 играет ретротранспозиция. Вне SET домена соответствующие растительные и животные белки не всегда уж столь консервативны. Дивергированные области белков предназначены для белок-белковых взаимодействий, это указывает на то, что растительные S ET доменные белки могли бы функционировать в других белковых комплексах, отличных от комплексов животных белков.

Хотя и неполная, доступная функциональная информация о SET доменных белках Arabidopsis указывает на то, что эти белки участвуют в регуляции активности хроматина и в эпигенетической наследственности. Первыми двумя генами SET доменных белков, идентифированными при генетическом скринировании, оказались Curly leaf ген (CLF) и ген Medea/независимое от оплодотворения образование семян (MEA/FIS1), которые являются негативными регуляторами, родственными гену E(Z) Drosophila. Будучи SET доменными белками, МЕА, CLF и E(Z) заодно являются также и PcG белками (раздел 2.3. Другие белки из группы polycomb). Мутации гена CLF приводят к изменению морфологии листа и гомеотическим изменениям в развитии цветка. MEA/FIS1 регулирует гаметофит-специфическую экспрессию генов и служит фактором импринтинга, который ингибирует развитие эндосперма без оплодотворения (Schubert et al., 2005). Наоборот, ген trithorax 1 (АТХ1) у Arabidopsis работает как активатор цветочных гомеотических генов, по-видимому, вследствие его способности катализировать метилирование четвертого лизинового остатка в гистоне H3 (H3K4), а это часто служит признаком транскрипционной активности хроматина (Hsieh and Fischer, 2005).

Криптонит/гомолог 4 супрессора 3-9 пестролистности (Suppressor of variegation 3-9 homolog 4 (КУР/ SUVH4) идентифицирован как супрессор эпигенетического сайленсинга двух эндогенных генов (Jackson et al., 2002; Malagnac et al., 2002). KYP/SUVH4 катализирует моно- и диметилирование гистона H3 по остатку лизина 9 (H3K9me2/me3) и действует вместе с ДНК-метилтрансферазой СМТЗ для поддержания CpNpG метилирования ряда последовательностей в геноме Arabidopsis. KYP/SUVH4 играет небольшую роль в образовании гетерохроматина (Chan et al., 2005). В отличие от этого гомолог 2 супрессора пестролистности 3-9 (SUVH2), идентифицированный при скрининге компонентов реактивации молчащего трансгена, обладает главной метилирующей активностью, модифицирующей гистон H3 по 9 (H3K9) и 27 (H3K27) остаткам лизина в гетерохроматине Arabidopsis (Naumann et al., 2005).

Лизиновые остатки в гистонах Н3 и Н4 могут быть моно-, ди- и триметилированными. Это сильно увеличивает комбинаторную сложность этих модификаций, определяет состояние гетерохроматина у разных организмов. Например, H3K9me3 служит отличительной чертой гетерохроматина у животных и грибов, а у Arabidopsis это — эпигенетический маркер эухроматина. Наоборот, H3K9mel и H3K9me2 — преимущественные маркеры неактивного хроматина у Arabidopsis, а у млекопитающих это показатели эухроматина. Происхождение этих различий и как они соотносятся с постулированным гистоновым кодом следует еще определить. Кроме этого, еще предстоит расшифровать и сильно взаимно перепутанные связи между специфическими модификациями гистонов и характером метилирования (Tariq and Paszkowski, 2004).

В отличие от ацетилирования гистонов, которое может динамично регулироваться противоположными активностями HDACs и HATs, метилирование гистонов до недавнего времени рассматривалось как перманентный эпигенетический маркер. Однако недавно у млекопитающих была найдена деметилаза метилированного лизина, LSD1, которая может деметилировать H3K4mel и H3K4me2, но не H3K4me3 (глава 10). В геноме Arabidopsis закодированы четыре предполагаемые LSD гомолога. Это указывает на то, что по-крайней мере некоторые метилирования гистонов у растений могут быть обратимыми.

2.3. Другие белки хроматина

PcG белки сначала были идентифицированы у Drosophila как факторы, необходимые для поддержания репрессии гомеотических генов (глава 11). У животных экспрессия генов подавляется структурно иными PcG белками, объединенными в мультибелковый комплекс. У растений и нематоды С. elegans нет комплекса PRC1, он имеется у Drosophila и млекопитающих. У растений и животных найден комплекс PRC2, он осуществляет преимущественно метилирование 27-го лизинового остатка у гистона H3 (H3K27) с помощью гистон-метилтрансфразной активности S ET домена и PcG белка E(Z).

У Arabidopsis гомологи основных компоннтов PRC2 найдены путем скринирования мутантов, полученных для анализа механизмов развития растения. У Drosophila PRC2 компоненты закодированы в виде единичных генов. Наоборот, у растений арабидопсиса эти гены содержатся по крайней мере в составе трех PRC2 комплексов -FIS (fertilization independent seeds, образование семян без оплодотворения), EMF (embryonic flower, эмбриональный цветок) и VRN (vernalization, яровизация), все они различаются по специфичности мишеней их воздействия (Schubert et al., 2005: рис. 11.2).

FIS гены идентифицированы при скрининге таких мутантов, у которых происходит частичное развитие семян независимо от оплодотворения. У них основной мишенью является MADS-box, содержащие транскрипционный фактор PHERES (Kohler et al., 2005). Компоненты EMF комплекса выявлены по их общей способности подавлять экспрессию таких цветочных гомеотических генов, как Agamous и Apeiala. Ген VRN2 из семейства VRN идентифицирован по его участию в эпигенетической памяти яровизации, которая определяется как выход семян из состояния покоя под воздействием холода.

Растения вынуждены программировать свою репродукцию во время соответствующего сезона, и в областях с умеренным климатом это осуществляется вследствие зацветания только после продолжительного холодового периода. Такая эпигенетическая память зимы нуждается в VRN2, который поддерживает индуцируемую холодом репрессию транскрипции гена, кодирующего ингибитор цветения FLC в последующие периоды при более высоких температурах. У мутантов vrn2 в FLC отсутствует H3K27me2, что согласуется с ролью комплекса PRC2 в метилировании гистонов (Schubert et al., 2005).

Родительский импринтинг свойствен лишь цветковым растениям и млекопитающим (табл. 9.1), этот эпигенетический феномен характеризуется тем. что материнские и отцовские гены экспрессируются по-разному. С учетом теории родительского конфликта в эволюции импринтинга (глава 19) импринтинг у цветковых растений и животных, по-видимому, отражает тот факт, что у этих организмов существует специфическая материнская ткань, которая поставляет питание для развивающегося зародыша. У млекопитающих это — плацента, а у растений триплоидный эндосперм — дифференцированная ткань, которая содержит один отцовский и два материнских генома (рис. 9.1). Явление родительского импринтинга одного гена впервые было выявлено в эндосперме кукурузы (Allemanand Doctor, 2000). В эндосперме Arabidopsis импринтирована экспрессия двух генов — МЕА и FWA (контролирует время цветения). В этих случаях активируются две материнские копии, по-видимому, вследствие катализируемого DME активного деметилирования CpG сайтов в женском гаметофите (см. раздел 2.1, подраздел «Активное деметилирование CpG и Д Н К гликозилазы»), в то время как отцовская копия неактивна (Autran et al., 2005). Удивительно то, что хотя у животных и растений импринтинг эволюционировал независимо, тем не менее, у тех и у других организмов для импринтинга необходимы метилирование ДНК и PcG белки (Kohler et al., 2005).

Switch2/caxapoзy неферментируюшие факторы 2 (SWI2/ SNF2) из консервативного семейства АТФ-зависимых ремоделирующих хроматин факторов способны сдвигать нуклеосомы или уменьшать прочность контактов между гистонами и ДНК. При генетическом скрининге получены данные примерно о 40 SWI2/SNF2 гомологах, закодированных в геноме Arabidopsis ((Plant Chromatin Database). Два из них — фактор 1 уменьшения метилирования ДНК (DDM1, Jeddeloh et al., 1999) и фактор 1 дефекта управлямого РНК метилирования ДНК (DRD1, Kanno et al., 2004) участвуют в регуляции метилирования ДНК. Дефектные по DDM1 мутанты с глобальным уменьшением степени метилирования геномной ДНК и транскрипционной реактивацией определенных молчащих транспозонов и повторяющихся последовательностей обнаруживают ряд серьезных нарушений в морфологии и развитии растений. Это выявляется после нескольких поколений инбридинга гомозиготных ddml растений вследствие накопления эпимутаиий и инсерционного мутагенеза реактивированными у мутанта транспозонами. DDM1 ортолог имеется у млекопиающих (Lymphoid-Specific Helicase (L5H), он важен для глобального CpG метилирования и эмбриогенеза. DRD1 уникален для мира растений и, по-видимому, играет специфическую роль в направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 3.4).

Мутации в молекуле Морфея (MOM, Amedeo et al., 2000), специфического для растений гена с неполным мотивом АТФ-завимой хеликазы, активируют некоторые повторяющиеся последовательности и не вызывают другие фенотипические изменения. МОМ функционирует синергично, но независимо от DDM1 метилирования ДНК. Это указывает на множественность путей регуляции транскрипции у растений (Tariq and Paszkowski, 2004).

Участие в специфических модификациях хроматина трех других белков с предполагаемой функцией ремоделирования хроматина — Splayed (SPD), фактор фотопериодически независимого раннего цветения (PIE) и Pickle (PKL), идентифицированых по их влиянию на развитие соответствующих дефектных мутантов, пока еще не установлено (Wagner, 2003).

В то время как SWI2/SNF2 белки, возможно, действуют на собранном хроматине, другие белковые факторы необходимы для восстановления структуры хроматина после репликации и репаративного синтеза ДНК. Комплекс факторов сборки хроматина (CAF), состоящий из трех субъединиц, помогает разместить полусобранные нуклеосомы у репликативной вилки. У Arabidopsis мутации (fasl,fas2) в генах двух больших CAF субъединиц вызывают характерные морфологические аномалии (фасциация, рис. 9.2е), дефекты в репарации ДНК и дерепрессируют повторяющиеся последовательности (Takeda et al., 2004). Это указывает на то, что правильное расположение нуклеосом в хроматине существенно для нормального развития растения и эпигенетического контроля. В то время как утрата CAF субъединиц не нарушает поддерживающее метилирование ДНК, она может приводить к стиранию других эпигенетических сигналов, таких как модификации гистонов. Снижение уровня содержания третьей CAF субъединицы MSI1 не вызывает фасцинирование, но приводит к нарушению формирования семян и различным фенотпическим изменениям (Hennig et al., 2005). Мутация в BRUгене, который не относится ни к одному из генов, кодирующих белки сборки хроматина, приводит к возникновению фенотипа, очень сходного с фенотипом fas мутантов. Возможно, что в сохранении эпигенетической информации и генетической целостности при пострепликативной сборке хроматина участвуют и другие дополнительные факторы (Takeda et al., 2004). Наконец, утрата RPA2, субъединицы белка А репликативного комплекса, вызывает увеличение чувствительности ДНК к повреждениям, транскрипционной дерепрессии и изменение модификации гистонов, но не влияет на характер метилирования ДНК (Elmayan et al., 2005; Kapoor et al., 2005b).

HP1 (гетерохроматиновый белок 1) у Drosophila и млекопитающих и его гомологи у грибов являются компонентами молчащего гетерохроматина. Присоединение НР1 его хромодоменом к метилированному по 9-му лизиновому остатку гистона H3 (H3K9me) способствует распространению состояния замалчивания генов и формированию гетерохроматиновых доменов В геноме Arabidopsis закодирован один-едиственный белок, гомологичный белку НР1 Drosophila. Мутации в этом гене, называемом LHP1 (Gaudin et al., 2001), или Terminal flower 2 (TFL2) (Kotake et al., 2003) приводят к изменению строения растения, развития листа и раннему зацветанию. Хотя фенотип этого мутанта указывает на важную роль в регуляции экспрессии гена, все же мало вероятно, что LHP1 действует на образование репрессированных комплексов хроматина подобно действию НР1 у других организмов. LHP1 у Arabidopsis регулирует функционирование локусов в хроматине, которые не являются мишенями для метилирования ДНК (Kotake et al., 2003; Tariq and Paszkowski, 2004). Таким образом, в результате эволюции LHP1 у растений и НР1 у других организмов выработались разные пути действия этих белков.

3. Молекулярные компоненты путей опосредованного PHKi сайленсинга

Современные эпигенетические исследования традиционно сфокусированы на изучении метилирования ДНК и модифицирования гистонов За последние несколько лет стало очевидно, что эти изменения в специфических областях генома могут происходить в результате интеференции РНК. Действительно сегодня уже невозможно рассматривать эпигенетическую регуляцию у многих организмов без участия компонентов аппарата интеферирующих РНК (PHKi) (Matzke and Birchler, 2005). Особенно это касается растений, у которых вклад работы этой машинерии в замалчивание генов гораздо выше, чем у всех других организмов.

3.1. Выработка PHKi-зависимого сайленсинга у растений

PHKi и сходные типы замалчивания (сайленсинга) генов представляют собой ответ клеток на двутяжевые РНК (dsPHK). dsPHK гидролизуется РНКаза 111-подобной эндонуклеазой (Dicer) с образованием маленьких РНК, которые и обеспечивают специфичность сайленсинга, комплементарно связываясь с соответствующей последовательностью-мишенью нуклеиновых кислот. Маленькие РНК включаются в мульти-белковые эффекторные комплексы, осуществляющие непосредственно деградацию информационных РНК и подавляют трансляцию (PTGS) или индуцируют модификации хроматина (TGS) в области определенных нуклеотидных последовательностей ДНК. Ключевой компонент этого эффекторного комплекса сайленсинга — белок по названию аргонавт, который связывает маленькие РНК с помощью своего PAZ домена. Индивидуальные белки из семейства белков аргонавтов, которое представляет собой самую большую группу белков, важных для PHKi-направляемого сайленсинга, сообщают функциональную специфичность разным эффекторным (исполнительным) комплексам (Carmel] et al., 2002). РНК-направляемое замалчивание генов участвует в защите от вирусов, контролирует транспозоны и играет существенную роль в развитии растений и животных.

Выработка PHKi-направляемого сайленсинга у растений отчасти отражает их коэволюцию с патогенами (РНК-содержащие вирусы, вироиды), которые образуют двутяжевые РНК (dsPHK) при репликации. На самом деле они наряду с транс генами (другой тип «чужеродных» нуклеиновых кислот) оказались бесценными для выявления и изучения разных форм PHKi-направляемого замалчивания генов у растений.

Разные пути PHKi-направляемого замалчивания генов продемонстрированы в результате

1. широкого выявления и функциональной диверсификации семейств генов, кодирующих основные компоненты для продуцирования PHKi: в геноме Arabidopsis закодированы четыре DICER-подобные (DCL) белка и десять белков аргонавтов (AGO);

2. обнаружения разных по длине и функционированию маленьких РНК, включая короткие, состоящие из 21 нуклеотидного остатка, интерферирующие РНК (siPHK), образующиеся из вирусов и трансгенов, и несколько типов эндогенных маленьких РНК (21-24 нуклеотидные микроРНК; 21-нуклеотидные трансдействующие siPHK и 24—26-членные гетерохроматиновые siPHK;

3. выявления разных типов генного сайленсинга, осуществляемого разными маленькими РНК: 1) PTGS (посттранскрипционный сайленсинг) по механизму деградации информационных РНК или путем подавления трансляции; 2) TGS (транскрипционный сайленсинг) связан с такими модификациями, как цитозиновое метилирование ДНК и метилирование гистонов;