Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

2.2. RIP — система защиты генома, имеющая как генетические, так и эпигенетические аспекты

RIP был открыт в результате детального анализа потомства от скрещиваний трансформантов Neurospora (Selker 1990). Обратили внимание на то, что дуплицированные последовательности — как нативные, так и чужеродные, как сцепленные, так и несцепленные — подвержены многочисленным поляризованным мутациям типатранзиций (G:C в А:Т) в гаплоидных геномах специальных двухъядерных клеток, получающихся в результате оплодотворения (рис. 6.12). Эксперименты, в которых стабильность гена тестировали, когда он был один в геноме или в комбинации с несцепленным гомологом, показали, что RIP не просто ассоциирован с повторами; он действительно индуцируется повторами. В дуплицированных последовательностях в одном пассаже с половым циклом могут мутировать примерно до 30 % пар G:C. Нередко (но не всегда) последовательности, измененные RIP, становятся метилированными de novo. Вполне вероятно, что мутации, индуцированные RIP, происходят путем ферментативного дезаминирования 5-meС или путем дезаминирования С, сопровождающегося репликацией ДНК (Selker, 1990). Метилирование цитозинов включает образование промежуточного соединения, склонного к спонтанному дезаминированию; это заставляет предполагать, что этап RIP, связанный с предполагаемым дезаминированием, мог бы катализироваться DMT или DMT-подобным энзимом. С этой возможностью согласуется тот факт, что один из двух гомологов DMT, предсказанных по геномной последовательности Neurospora, участвует в RIP (Freitag et al., 2002). Потомство от гомозиготных скрещиваний мутантов с дефектами в этом гене, rid (RIP defective), не дает новых случаев RIP. Мутанты rid не обнаруживают сколько-нибудь заметных дефектов в метилировании ДНК, фертильности, росте или развитии. Напротив, второй гомолог DMT у Neurospora (DIM-2), который был идентифицирован генетически и который, как было показано, необходим для всех известных видов метилирования ДНК, не требуется для RIP (Kouzminova and Selker, 2001).

Рис. 6.12. Мутации от RIP и статус метилирования восьми аллелей am

^{Вертикальными линиями обозначены мутации. Аллели, изображенные черным цветом, были неметилированными, аллели, изображенные синим, были первоначально метилированными, но, после того, как с помощью 5-азацитидина или путем клонирования и замещения гена была индуцирована утрата метилирования, не стали реметилированными. Аллели, изображенные красным цветом, были не только изначально метилированы, но и включали метилирование de novo (из Singer et al., 1995, с изменениями)}

Все указывает на то, что каждая дупликация достаточной величины (больше чем ~400 п.н. для тандемной дупликации или -1000 п.н. для несцепленной дупликации) подвержена RIP в некоторой доле специальных двухъядерных клеток. Тем не менее, дупликации с некоторой частотой (обычно менее 1 % для тандемной дупликации или -50 % для несцепленной дупликации) избегают RIP. Даже дупликации хромосомных сегментов, содержащих многочисленные гены, чувствительны к RIP (Perkins et al., 1997; Bhat and Kasbekar, 2001). Хотя RIP ограничен половой фазой жизненного цикла, существование этого процесса ставит вопрос о том, может ли Neurospora использовать дупликации генов для эволюции. В геномной последовательности обнаружили семейства генов, но практически все паралоги, как оказалось, достаточно дивергировали, чтобы не включать RIP (Galagan and Selker, 2004). Мы приходим к заключению, что RIP действительно может ограничивать эволюцию у Neurospora. Интересно, что некоторые грибы демонстрируют то, что, по-видимому, является мягкими системами защиты генома, сходными с RIP. Наиболее заметный пример — премейотически индуцируемое метилирование (MIP), процесс, выявляющий сцепленные и несцепленные дупликации последовательностей в период между оплодотворением и кариогамией подобно RIP, но зависящий для инактивации исключительно от метилирования ДНК; в последовательностях, инактивированных MIP, не было обнаружено никаких свидетельств мутаций (Rossignol and Faugeron 1994).

2.3 Исследования реликтов RIP позволило проникнуть в контроль метилирования ДНК

Обнаружение того, что одна DMT, а именно DIM-2, ответственна за все выявляемое метилирование ДНК, было столь же удивительным, как и первоначальное обнаружение безудержного Irampant] метилирования в несимметричных сайтах у Neurospora, поскольку ни для одной ранее идентифицированной DMT не было известно, чтобы она метилировала цитозины в разнообразных по последовательности контекстах. Очевидный, но важный вопрос заключался в следующем: обязательно ли метилирование в несимметричных сайтах отражает потенциальную способность соответствующих последовательностей индуцировать метилирование de novo? Ранние опыты по трансформации не противоречили такой возможности; метилированные последовательности, лишенные их метилирования (например, с помощью клонирования), вновь обретали свое нормальное метилирование, будучи реинтродуцированы в вегетативные клетки. С сюрпризом столкнулись, однако, когда восемь аллелей гена ат, сгенерированных RIP, были протестированы на их способность индуцировать метилирование de novo (Singer et al., 1995). Некоторые продукты RIP с относительно немногочисленными мутациями (рис. 6.12, amRIP3 и amRIP4) не сделались реметилированными, даже в своем нормальном локусе; это позволяло предположить, что наблюдаемое метилирование представляло собой воспроизведение метилирования, установленного ранее. Важно отметить, что их метилирование, подобно другому метилированию, наблюдаемому у Neurospora, не было ограничено симметричными сайтами, не распространялось сколько-нибудь существенно с течением времени и было «гетерогенным» в том смысле, что паттерн метилированных остатков не был инвариантным в пределах клональной популяции клеток. Таким образом, это метилирование, хотя и зависимое от предшествовавшего метилирования, установленного в половой фазе (вероятно, с помощью RIP), могло не отражать действие «поддерживающей метилазы» того типа, который предполагался в оригинальной модели наследования паттернов метилирования. Заслуживает внимания, что MIP у Ascobolus, результатом которого также является гетерогенное метилирование, представляет первое доказательство воспроизведения метилирования ДНК у грибов (Rossignol and Faugeron, 1994). Способность Neurospora осуществлять поддерживающее метилирование была подтверждена экспериментально (Selker etal., 2002). Интересно, что воспроизведение метилирования оказалось сиквенс-специфичным (т.е. оно работает не на всех последовательностях), что добавляет новое измерение к концепции поддерживающего метилирования Хотя можно представить себе ряд возможных схем, результатом которых будет воспроизведение метилирования ДНК, действительный механизм, работающий у Neurospora, остается неизвестным. В принципе, поддержание метилирования в несимметричных сайтах могло бы зависеть от метилирования близлежащих симметричных сайтов, но наблюдаемое гетерогенное метилирование, включая сайты CpG, делает этот вариант маловероятным. Механизмы обратной связи с участием белков, ассоциированных с метилированной ДНК, могли бы приводить к метилированию, зависящему от предсуществующего метилирования, т.е. к поддерживающему метилированию. Как обсуждается ниже, данные, полученные на Neurospora (и других организмах), означают участие модификаций гистонов в контроле метилирования ДНК, указывая тем самым на возможную роль гистонов в поддерживающем метилировании

Первым указанием на роль гистонов в метилировании ДНК было наблюдение, что обработка Neurospora ингибитором деацетилазы гистонов трихостатином А (TSA) снижала уровень метилирования в некоторых хромосомных районах (Selker, 1998). Селективность деметилирования под воздействием TSA могла бы отражать дифференциальный доступ к ацетилтрансферазам гистонов, но это не было достаточно тщательно исследовано (Selker et al., 2002). Благодаря исследованиям с мутантом dim-5 у Neurospora хроматин был однозначно связан с контролем метилирования ДНК. Этот мутант, подобно штаммам dim-2, обнаруживает полную утрату метилирования ДНК. SET-доменный белок DIM-5 оказался метилтрансферазой гистона H3, которая специфически триметилирует лизин 9 (Tamaru and Selker, 2001; Tamaru et al., 2003). Подтверждение того, что гистон H3 является физиологически релевантным субстратом DIM-5, дали два наблюдения: (1) замещение лизина 9 в H3 другими аминокислотами вызывает утрату метилирования ДНК и (2) триметил-лизин 9 обнаруживается специфически в метилированных участках хромосом.

Открытие того, что метилирование гистонов контролирует метилирование ДНК, по крайней мере у Neurospora, привело к постановке двух важных вопросов: (1) Что говорит белку DIM-5, какие нуклеосомы надо метилировать? (2) Что считывает триметильную метку и передает эту информацию к DMT, DIM-2? Факторы, контролирующие DIM-5, не были определенным образом идентифицированы, но имеются серьезные предположения, что он контролируется одним или несколькими белками, распознающими продукты RIP, и состоянием модификации аминокислотных остатков по соседству с местом его действия (Selker et al., 2002). Последнее должно давать возможность DIM-5 интегрировать информацию о том, должна ли быть метилирована ДНК в определенном участке, и дает возможное объяснение наблюдению, что TSA может ингибировать метилирование ДНК в некоторых районах.

Данные, полученные на других системах, привели к открытию того, что считывает триметильную метку на лизине 9 гистона H3 у. Знания о том, что НР1, белок, впервые идентифицированный у Drosophila (глава 5), связывается с метилированным лизином 9 гистона H3 in vitro, стимулировали поиски гомолога HPI у Neurospora. Вероятный гомолог был найден, и его участие в метилировании ДНК было протестировано методом дизрупции гена (Freitag et al., 2004а). Ген, названный hpo (НРопе), действительно оказался существенным для метилирования ДНК. Для еще одной проверки того, считывает ли НР1 у Neurospora метку, сгенерированную DIM-5, изучили его субклеточную локализацию у штаммов дикого типа и dim-5 У дикого типа HP1-GFP локализовался в гетерохроматиновых фокусах, но эта локализация была утрачена у dim-5; это подтверждало, что HPI Neurospora рекрутируется меткой (триметиллизин 9), сгенерированной DIM-5.

Данные о том. что РНК-интерференция (RNAi) играет важную роль в формировании и поддержании гетерохроматина у S. pombe, ставят вопрос о том, участвует ли машинерия RNAi у Neurospora в локализации НР1 и (или) метилировании ДНК. У Neurospora есть гомологи ряда генов, участвующих в RNAi (Borkovich et al., 2004).

Исследования мутантов с нуль-мутациями во всех трех генах РНК-зависимой PHК-полимеразы (RdRP), в обоих генах Dicer или в других генах, предположительно относящихся к RNAi, не обнаружили никаких свидетельств того, что RNAi участвует в метилировании H3K9. формировании гетерохроматина или метилировании ДНК у Neurospora (Chicas et al., 2004; Freitag et al., 2004c). Однако, как обсуждается ниже, гены RNAi у Neurospora принимают участие, по крайней мере, в двух других механизмах сайленсинга, имеющих эпигенетические аспекты: в «подавлении» (quelling) и в мейотическом сайленсинге.

2.4. «Подавление» (quelling)

Вскоре после того, как для Neurospora были разработаны методы трансформации, исследователи в нескольких лабораториях заметили, что заметная доля (например, ~30 %) трансформантов Neurospora обнаруживают сайленсинг трансформирующей ДНК и, что еще более удивительно, сайленсинг нативных последовательностей, гомологичных последовательностям трансформирующей ДНК. Эта последняя форма сайленсинга в вегетативной фазе была названа лабораторией Макино (Macino) «подавлением» («quelling»). К настоящему времени эта лаборатория выполнила большую часть исследований этого феномена (Pickford et al., 2002). Подавление выглядит наиболее демонстративно с видимыми маркерами, такими как гены albino, которые кодируют ферменты, необходимые для биосинтеза каротиноидов (рис. 6.13). Полагают, что оно сопоставимо с «косупрессией» или _ посттранскрипционным сайленсингом генов (PTGS) у растений. Интересно, что гены, по-видимому, варьируют по своей чувствительности к подавлению. Для генов, которые чувствительны, подавление кажется самым обычным у трансформантов, несущих множественные копии трансформирующей ДНК, расположенные компактно. Ядра свободно плавают в гифах Neurospora, создавая ситуации «гетерокариоза», в которых генетически различающиеся ядра находятся в общей цитоплазме. Таким образом, легко показать, что «подавление» является «доминантным»; т.е. трансформированное ядро может сайленсировать гомологичные последовательности в соседних ядрах (Cogoni et al., 1996). Это предполагает наличие цитоплазматического фактора сайленсинга, возможно какой-то РНК. В согласии с этой возможностью идентификация генов, участвующих в «подавлении», показала, что «подавление» тесно связано с RNAi в других системах (Pickford et al., 2002). Говоря конкретно, qde-1, qde-2, qde-3, dcl-1 и dcl-2 кодируют, соответственно, RdRP, белок, подобный белку “Argonaute”, который, как полагают, участвует в направляемом малыми интерферирующими РНК (siRNA) расщеплении иРНК (Baumberger and Baulcombe 2005), RecQ-подобную презумптивную ДНК-геликазу (йву-3) и два «Dicer», которые предположительно участвуют в образовании siRNA (Catalanotto et al., 2004). Хотя критические детали пока отсутствуют, разрабатываемая модель сводится к тому, что в некоторых случаях трансформирующая ДНК генерирует «аберрантный» транскрипт, который каким-то образом включает машинерию RNAi, что ведет к деградации гомологичных иРНК. Хотя метилирование

ДНК часто связано с трансформирующей ДНК, ни метил-трансфераза ДНК, DIM-2, ни метилтрансфераза лизина 9 гистона H3, DIM-5, для подавления не нужны (Cogoni et al., 1996; Chicas et al., 2005).

Рис. 6.13. Подавление (quelling)

^{Для простоты изображены лишь две из семи хромосомы (отрезки прямых линий в серых кругах, представляющих ядра). Нативный ген albino (al) показан темно-оранжевым прямоугольником на верхней хромосоме; другой (темно-оранжевый или желтый) прямоугольник представляет эктопические последовательности al, введенные путем трансформации. Поскольку трансформированные клетки часто являются многоядерными, трансформанты, как показано, часто бывают гетерокариотическими. Независимо от того, включает ли трансформирующая ДНК весь кодирующий район или нет, у некоторых трансформантов он сайленсирует («подавляет») нативный ген аl+ как в трансформированных, так и в нетрансформированных ядрах посредством неидентифицированной trans-действующей молекулы (красные линии, отходящие от трансформирующей ДНК, обозначенной желтым прямоугольником). Результатом этого оказывается слабопигментированная или альбинотическая (Аl-) ткань у некоторых трансформантов, как это показано на рисунке}

2.5. Мейотический сайленсинг, осуществляемый неспаренной ДНК (MSUD)

MSUD, самое недавнее добавление к списку механизмов сайленсинга, действующих у Neurospora, был открыт Метценбергом и его сотрудниками (Агашауо and Metzenberg, 1996; Shiu et al., 2001; Shiu and Metzenberg, 2002) в ходе анализа любопытного наблюдения, заключавшегося в том, что мутация типа делеции в гене Asm-1 (созревание аскоспор) является функционально доминантной. Серия элегантных экспериментов, изображенная на рис. 6.14, привела к выводу, что последовательности, лишенные партнера по спариванию в мейотической профазе, вызывают мейотический сайленсинг идентичных или почти идентичных последовательностей. Наблюдение, что деления Awz-1 является доминантной (рис. 6.146), могло объясняться тем, что остающаяся единичная доза гена продуцирует неадекватный генный продукт, но эту возможность сделало маловероятной наблюдение, что функциональная копия этого гена в эктопическом положении не может комплементировать дефект (рис. 6.14в). Напротив, только одна функциональная копия этого гена требовалась в мейозе, если у функциональной аллели был партнер по спариванию, т.е. ее партнер мог нести мутации, делающие его неспособным производить функциональный продукт (рис. 6.14г). Нормальная мейотическая экспрессия этого гена наблюдалась у штамма, имеющего спаренные эктопические аллели и делеции нативного гена на обоих гомологах, что свидетельствовало о том, что сама по себе делеция не была «токсичной» и что эктопические копии действительно были функциональными (рис. 6.14д). Интересно, что некоторые аллели, индуцированные RIP, вызывают (elicit) MSUD, если эти штаммы способны к метилированию ДНК. но не могут вызвать MSUD в штаммах dim-2; это заставляет предполагать, что метилирование ДНК, нередко ассоциированное с такими аллелями, может подавлять спаривание (сравни рис. 6.14 г и 6.14 е) (Pratt et al., 2004). (Кстати говоря, это наблюдение дает нам также первое доказательство того, что DIM-2 является функциональным в половой фазе Neurospora.) Аллели с высокой плотностью мутаций, индуцированных RIP, оказались, подобно делециям, доминантными (рис. 6.14ж) (Shiu et al., 2001; Shiu and Metzenberg, 2002; Pratt et al., 2004), что согласуется с гипотезой о том, что они не способны спариваться с аллелью дикого типа Для того чтобы разграничить две возможности — что MSUD обусловлен отсутствием спаривания и что он обусловлен присутствием неспаренной аллели, — исследователи проанализировали скрещивание, в котором мейотическое ядро имело три копии гена: две аллели дикого типа (которые должны спариваться) и эктопическую копию (которая должна быть неспаренной). Наблюдался сайленсинг, что означало, что MSUD является результатом присутствия неспаренных аллелей, а не отсутствия спаренных аллелей (рис. 6.14з). MSUD можно наблюдать цитологически в скрещиваниях, гетерозиготных по гену, кодирующему белок, меченный [таггированный — tagged] GFP, как это показано на рис. 6.15.

Охота за мутантами, дефектными по MSUD, привела к идентификации эффективного [telling] члена машинерии MSUD. Ген Sad-1 (Supressor of ascus dominance — супрессор доминантности асков), идентифицированный путем отбора мутантов, способных проходить через скрещивание, в котором asm-1 не спарен, кодирует RdRP (Shiu et al., 2001). Это позволяло предполагать, что MSUD родствен «подавлению» (quelling) у Neurospora и, в целом, RNAi. Интересно, что геном Neurospora содержит гены, которые, согласно предсказанию, кодируют три предполагаемых RdRP (одна, необходимая для «подавления», одна — для MSUD и одна с неизвестной функцией), два белка, подобных Argonaute (один для «подавления» и один для MSUD) и два белка, подобных Dicer. Было бы замечательно, если бы удалось выяснить детальный механизм MSUD

Рис. 6.14. Мейотический сайленсинг. вызываемый неспаренной MHK(MSUD)

^{Изображение тестов, проведенных в лабораториях Метценберга и Арамайо (Aramayo and Metzenberg, 1996; Shiuetal., 2001; Prattet al., 2004), описавших это явление Показаны только две из семи хромосомы Neurospora; их нуклеотидные последовательности изображены, соответственно, зеленым и синим цветом Прямоугольником показан ген, нормально функционирующий в мейозе. Вертикальными линиями показаны мутации, а метилирование ДНК показано красным цветом. Делеции изображены в виде пустых промежутков. Пояснения см. в тексте}

2.6. Вероятные функции и практическое использование RIP, «подавления» и MSUD

RIP, по-видимому, «изготовлен по специальному заказу», чтобы ограничить экспрессию «эгоистичной ДНК», такой как транспозоны, которые управляют производством собственных копий в геноме. В соответствии с этой возможностью, огромное большинство реликтов RIP обладает очевидным сходством с транспозонами, известными у других организмов, а большинство штаммов Neurospora не имеют активныхтранспозонов (Galagan et al., 2003; Selker et al., 2003). Тем не менее, поскольку RIP ограничен премейотическими двухъядерными клетками, этот процесс не должен ни предотвращать распространение нового (например, «горизонтально» приобретенного) транспозона в вегетативных клетках, ни препятствовать дупликации однокопийного транспозона в мейотических клетках.

Рис. 6.15. Neurospora crassa

^{Флуорограмма розетки созревающих асков от гетерозиготного скрещивания трансформанта, сконструированного таким образом, что он экспрессирует гистон Н1, меченный (tagged) GFP Четыре аскоспоры в каждом аске обнаруживают светящиеся ядра (Freitag et al., 2004b) (фото любезно предоставлено N.B. Raju, Stanford University)}