Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

^{Два интерфазных ядра с гетерохроматином (центромеры, теломеры и «молчащие» локусы mat2-mat3), декорированных красной флуоресцентной иммунолокализацией Swi6, и кинетохорный хроматин (только центромеры), декорированный зеленой флуоресцентной иммунолокализацией CENP-ACnp1. Красные сигналы не в самом соседстве с зелеными представляют теломеры или mat2-mat3. Все нентромеры собраны в кластер на периферии ядра рядом с организующим центром митотического веретена}

Центромерные районы не полностью лишены генов, и любопытно, что несколько генов тРНК находятся между внешними повторами и центральным кинетохорным районом (рис. 6.2а) (Kuhn et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Недавно было показано, что они действуют как барьер, предотвращая вторжение гетерохроматина в центральный домен (Scott et al., 2006).

1.4. Центромерные внешние повторы без посторонней помощи делают возможной сборку «молчащего» хроматина

Зависимый от Clr4 «молчащий» хроматин собирается не только в центромерах, но и над районом размером около 20 т.о., содержащим «молчащие» локусы типа спаривания (mat2-mat3) (Noma et al., 2001) и соседствующим с терминальными теломерными повторами (консенсус TTACAGG), добавляемыми теломеразой (Nimmo et al., 1994, 1998; Allshire et al., 1995; Kanohetal., 2005). Район cenH (т.е. гомологичный центромере), который находится "Между mat2 и mat3, имеет большое сходство, свыше ~7 т.о., с внешними повторами, обнаруживаемыми в центромерах (Grewal and Klar, 1997). Кроме того, по крайней мере 0.5 т.о. нуклеотидных последовательностей ДНК, имеющих >84 % идентичности с повторами cenH, могли бы действовать в cis-конфигурации, осуществляя сборку «молчащего» хроматина.

Сборка зависимого от Clr4 «молчащего» хроматина происходит даже на соседних маркерных генах, когда центромерный внешний повтор (dg) или нуклеотидные последовательности mat2-mat3 (cenH) вставляются в районы генома, где в норме сайленсинг не происходит («эктопический» сайленсинг; рис. 5) (Ayoub et al., 2000; Partridge et al., 2002; Volpe et al., 2003). Простое объяснение могло бы заключаться в том, что связывающиеся с ДНК белки узнают эти повторы и, когда связываются, эти белки рекрутируют HDACs и HKMT Clr4, результатом чего является метилирование H3K9, связывание хромодоменных белков и формирование гетерохроматина. Однако ситуация на самом деле еще более сложная. Теперь известно, что центромерные внешние повторы транскрибируются. Замечательно, что эта транскрипция приводит к образованию двухнитчатой РНК (dsRNA) — субстрата для RNAi-машинерии, — а она затем рекрутирует Clr4 HKMT для включения сборки «молчащего» хроматина (Volpe et al., 2002; Sadaie et al., 2004). RNAi также действует на родственные повторы cenH, обнаруживаемые в районе mat2-mat3 и в повторах TAS в теломерах (Cam et al., 2005; Kanoh et al., 2005).

Рис. 6.5. Нуклеотидные последовательности центромерных повторов опосредуют сайленсинг

^{Вставка фрагментов (1—2 т.о.) рядом с экспрессируемым геном ura4+ в локусе, который в норме не склонен к сайленсингу, приводит к метилированию НЗК9, связыванию Swi6 и Chp1 и транскрипционному сайленсингу}

Однако картина еще более усложняется тем обстоятельством, что в mat2-mat3 RNAi действует, устанавливая «молчащий» хроматин, в то время как связывающиеся с ДНК белки Arf1 и Perl связываются вблиз cenH и поддерживают «молчащий» хроматин над mat2-mat3 даже в отсутствие ключевых компонентов RNAi (Jia et al., 2004; Kim et al., 2004). Аналогично этому, перекрывающиеся механизмы сайленсинга действуют и в теломерах; терминальные повторы без посторонней помощи могут рекрутировать Clr4 HKMT и. таким образом, Swi6 через связывающийся с теломерными повторами белок Tazl, но RNAi действует также через cenH-часть элементов TAS, формируя расширенный район «молчащего» хроматина в теломерах (Nimmo et al., 1994; Allshire et al., 1995; Kanoh et al., 2005). Существует ли сравнимый перекрывающийся механизм для поддержания «молчащего» хроматина в центромерах? Хотя в клетках, лишенных RNAi, сайленсинг репортерных генов внешних повторов и самих транскриптов центромерных внешних повторов является дефектным, H3K9me2 сохраняется на хроматине внешних повторов в отсутствие компонентов RNAi (Sadaie et al., 2004). Какие факторы отвечают за поддержание этого метилирования? Одна возможность заключается в том, что белки, родственные CENP-B (Abpl, Cbhl, Cbh2), содержащие консервативный связывающийся с ДНК домен, связываются с ДНК центромерных повторов и являются необходимыми для эффективного формирования «молчащего» хроматина (Irelan et al., 2001; Nakagawa et al., 2002) Другие наблюдения показывают, что HDAC Clr4 также действует независимо от RNAi, поддерживая целостность гетерохроматина (Yamada et al., 2005).

1.5. РНК-интерференция направляет сборку «молчащего» хроматина

Феномен RNAi был впервые открыт у Caenorhabditis elegans, где было найдено, что результатом экспрессии dsRNA является утрата экспрессии гомологичного гена. Вскоре стало очевидным, что эта форма RNAi связана с процессом транскрипционного сайленсинга генов (TGS), описанного у растений, и подавлением [quelling] у N. crassa (описывается ниже).

У растений и многоклеточных животных известно, что dsRNA, будучи подвергнута процессингу с помощью машинерии RNAi, дает малые РНК, которые осуществляют модификации ДНК и (или) хроматина на гомологичном хроматине. Наличие у дробянковых дрожжей ортологов основных компонентов пути RNAi, т.е. Argonaute (Ago1), Dicer (Dcrl) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (Rdpl), стимулировало их исследование у этих организмов (Volpe et al., 2002), что привело к значительным успехам в понимании опосредованных RNAi модификаций хроматина и сайленсинга.

Фенотипические последствия утери функции Ago1, Dcr1 или Rdpl сходны с таковыми у мутантов swi6: пониженное содержание H3K9me2 и потеря сайленсинга над внешними повторами центромер (рис. 6.36). Однако у мутантов по RNAi были выявлены перекрывающиеся некодирующие РНК-транскрипты (ncRNA) дискретной величины, происходящие с центромерных внешних повторов. Эти ncRNA гомологичны естественно встречающимся малым РНК, называемым короткими интерферирующими РНК (siRNAs; ~21 н.), которые изолированы и секвенированы у S. pombe (Reinhart and Bartel, 2002; Cam et al., 2005). Эти siRNAs генерируются Dicer (компонентом RNAi) посредством расщепления двунитчатых дериватов гомологичных некодирующих транскриптов длинного центромерного повтора [mediated by cleavage of the double-stranded derivatives of the long centromere repeat homologous noncoding transcripts].

Хромодоменный белок Chp1 также оказывается компонентом машинерии RNAi. Chp1 связывается с хроматином H3K9me2 и необходим для сайленсинга репортерных генов во внешних повторах центромер, но он также требуется и для генерации siRNAs, гомологичных центромерным повторам (Noma et al., 2004), и для нормальных уровней метилирования H3K9 на центромерных повторах (Partridge et al., 2002; Sadai et al., 2004). Роль Chp1 была далее подтверждена идентификацией эффекторного комплекса RITS (RNA-induced transcriptional silencing), который содержит Chp1, Ago1, Tas3 и siRNAs, гомологичные центромерным внешним повторам (Motamedi et al., 2004). Кроме RITS был идентифицирован комплекс, содержащий Rdpl (RDRC — RNA-directed RNA polymerase complex), который содержит предсказанную РНК-геликазу (Hrrl) и предполагаемую поли (А) полимеразу (Cidl2). Эти компоненты, по-видимому, также являются важной составной частью процесса RNAi и сборки интактного «молчащего» хроматина на внешних повторах в центромерах (рис. 6.6) (Motamedi et al., 2004).

Наличие независимого от RNAi (и зависимого от Atfl/Pcrl) механизма сайленсинга, действующего в «молчащем» локусе типа спаривания для поддержки гетерохроматина, было обнаружено путем обработки клеток без RNAi ингибитором HDAC трихостатином А (TSA). Результатом этого явилась полная утрата «молчащего» хроматина из района mat2-mat3, имитирующая эффект делетирования atfl или pcrl у мутантов по RNAi (Hall et al., 2002; Jia et al., 2004). Однако, как отмечалось выше, для формирования «молчащего» хроматина в центромерных внешних повторах Atfl и Perl не требуются (Kim et al., 2004). Кратковременное воздействие TSA также вызывает утрату сайленсинга в центромерах, приводя к гиперацетилированию гистонов, сопряженных с дефектной функцией центромеры (Ekwall et al., 1997). Хотя это индуцированное TSA «эписостояние» является метастабильным, оно может воспроизводиться в нескольких циклах клеточного деления и даже в мейозе Наиболее вероятное объяснение заключается в том, что гетерохроматин трудно установить заново, коль скоро достигается это аномальное гиперацетили-рованное состояние. Эписостояния могут также устанавливаться в нарушенном (compromised) локусе mat2-mat3, и они тоже воспроизводятся в мейозе (Nakayama et al., 2000).

1.6. Транскрипция центромерных повторов РНК-полимеразой II связывает RNAi с модификациями хроматина

В предыдущем разделе было показано, что RNAi и модификации гистонов необходимы для сборки центромерного гетерохроматина, который может распространяться на соседние вставленные репортерные гены. Эти наблюдения поднимают такие очевидные вопросы, как вопрос о том, каким образом RNAi связана с ковалентной модификацией гистонов в формировании «молчащего» хроматина, и вопрос о том, как конкретные районы генома становятся мишенью для такой направляемой RNAi модификации хроматина и сайленсинга.

У многих организмов экспрессия специфических dsRNA, гомологичных рассматриваемому гену, приводит либо к транскрипционному (модификация ДНК/хроматина) сайленсингу гена (TGS), либо к посттранскрипционному (деградация иРНК) сайленсингу гена (PTGS). Может ли любая dsRNA у дробянковых дрожжей процессироваться так, что образует siRNAs, и индуцируют ли такие siRNAs только посттранскрипци-онный сайленсинг (РНК-нокдаун) или же они могут осуществлять также и модификации хроматина (например, H3K9me2), которые сайленсируют транскрипцию с гомологичного гена? Экспрессия dsRNAs, гомологичных репортеру GFR, продуцирует siRNAs, которые вызывают редукцию транскриптов GFP, но транскрипционная активность репортерного гена GFP не снижается

Таким образом, хотя GFP-siRNAs понижают уровни иРНК GFP, они не способны осуществлять модификации хроматина, которые приводят к транскрипционному сайленсингу. Эти GFP-siRNAs должны, следовательно, действовать лишь посттранскрипционно, разрушая иРНК GFP (Sigova et al., 2004). Неясно, почему GFP-siRNAs не индуцируют модификацию хроматина на гомологичном гене, но это может быть связано с природой синтезирующегося транскрипта или с силой промотора RNA pol II, приводящей в действие экспрессию GFP.

Какая РНК-полимераза отвечает за транскрипцию центромерных повторов? Мутация любой из двух субъединиц RNApol II (Rpb2 и Rpb7) приводит к дефектному сайленсингу центромер (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005), хотя эти мутации демонстрируют очень разные фенотипы. У мутанта rpb7-1 обнаруживаются пониженные уровни транскрипции центромерных повторов, что приводит к меньшему образованию ncRNA и, следовательно, меньшему образованию siRNA и утрате «молчащего» хроматина. Это означает, что RNA pol II необходима для транскрипции центромерных повторов, чтобы обеспечить первичный субстрат для RNAi. Напротив, у мутанта грЬ2-т203 центромерные транскрипты образуются, но они не процессируются в siRNA, и содержание H3K9me в центромерах уменьшается. Эти исследования показывают не только то, что для RNAi требуется транскрипт RNApol II, но и что, подобно другим событиям процессинга РНК, образование центромерной siRNA может быть сопряжено с транскрипцией через взаимодействия между машинерией RNAi, хроматином, модифицирующими ферментами и RNA pol II (рис. 6.6). Возможно, что ассоциированные с RITS siRNAs могут «наводиться» на синтезируемые транскрипты по мере того, как они появляются из RNA pol II, занятой гомологичным локусом. Коль скоро происходит узнавание, комплекс RITS-siRNA мог бы стабилизироваться на этих транскриптах, результатом чего могло бы стать рекрутирование таких модифицирующих хроматин активностей, как Clr4 Удивительно, что центромерные siRNAs также исчезают в клетках, лишенных активности HKMT Clr4 (Noma et al., 2004; Hong et al., 2005). Возможно, что отсутствие Clr4 влияет на продукцию siRNA путем дестабилизации связей между различными компонентами в интерфейсе между транскрипцией, RNAi и модификацией хроматина (Motamedi et al., 2004). Альтернативная возможность сводится к тому, что метилирование H3K9 может быть необходимо для того, чтобы сделать возможным генерацию siRNAs в cis-конфигурации посредством действия различных активностей, осуществляющих процессинг РНК (например, RdRP), на первичные центромерные транскрипты (рис. 6.6) (Noma et al., 2004; Sugiyama et al., 2005; глава 8).

1.7. «Молчащий» хроматин в центромерах необходим для опосредования когезии сестринских центромер и нормальной сегрегации хромосом

Как гетерохроматин центромерных внешних повторов и CENP-A^Cnp1-хроматин кинетохора влияют на общую функцию расхождения хромосом? Зависимый от Clr4 «молчащий» хроматин собирается на внешних повторах в центромерах, в родственном повторе в локусе типа спаривания и по соседству с теломерами. Эксперименты с «голыми» плазмидными ДНК-конструктами [naked DNA plasmid constructs] показали, что внешние повторы каким-то образом вносят свой вклад в сборку функциональной центромеры, наделяя эти Cen-плазмиды способностью сегрегировать на митотическом и мейотическом веретене. Но ни внешних повторов, ни центрального домена самих по себе недостаточно для сборки функциональной центромеры (Clarke and Baum, 1990; Takahashi et al., 1992; Baum et al., 1994; Ngan and Clarke, 1997; Pidoux and Allshire, 2004).

Puc. 6.6. Транскрипция центромерных повторов связывает RNAi, образование гетерохроматина и когезию

^{Транскрипция внешних повторов с помощью RNA pol II обеспечивает первичный субстрат для RNAi и зависимого от Dicer образования siRNA. Загрузка Ago1 в комплексе RITS (Ago1, Tas3, Chp1) молекулами siRNA делает возможным «нацеливание» гомологичного транскрипта. Действие RDRC (Rdpl, Cidl2 и Hrrl) делало бы возможной продукцию dsRNA, обеспечивая большее количество субстрата для Dcr1 для производства siRNA и, возможно, усиления сигнала. Взаимодействия между транскриптом, субъединицами RNA pol II и компонентами RNAi рекрутируют Clr4, который метилирует гистон H3 по лизину 9, делая возможным связывание хромодоменных белков, рекрутирование когезина и когезию сестринских центромер}

Мутанты, вызывающие утрату сайленсинга во внешних повторах (т.е. дефектные по Clr4, компонентам RNAi или Swi6), повысили частоту утери хромосом в митозе и встречаемость отстающих хромосом на веретенах поздней анафазы (рис. 7а) (Allshire et al., 1995; Ekwall et al., 1996; Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002; Hall et al., 2003; Volpe et al., 2003). Клетки без Swi6 дефектны по когезии в центромерах, но сохраняют когезию вдоль хромосомных плеч (Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002). Формирование должным образом би-ориентированного веретена требует, чтобы сестринские кинетохоры прикреплялись к микротрубочковым фибрилам, отходящим от противоположных полюсов веретена. Силы, прилагаемые к би-ориентированным кинетохорам, требуют, чтобы сестринские кинетохоры прочно удерживались вместе (рис. 6.76). Swi6 необходим для рекрутирования когезина к хроматину внешних повторов и, тем самым, опосредует прочную физическую когезию между сестринскими центромерами (рис. 6.6). Таким образом, одна из функций «молчащего» хроматина в центромерах — быть посредником в когезии.

Когезин также прочно ассоциирован с теломерами и районом mat2-mat3 (Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002). Кроме того, когезин также рекрутируется к «молчащему» хроматину, сформированному на гене ura+ в ответ на расположенный рядом эктопический центромерный повтор (рис. 6.5), подчеркивая связь между «молчащим» хроматином и когезией (Partridge et al., 2002). Таким образом, рекрутирование когезина, по-видимому, является общим свойством ассоциированного со Swi6 «молчащего» хроматина. Каким образом Swi6-хроматин осуществляет рекрутирование когезина — неизвестно, но Swi6 взаимодействует с субъединицей Psc3 когезина (Nonaka et al., 2002). Кроме того, Dfp1, регуляторная субъединица консервативной киназы Hskl (Cdc7), взаимодействует с Swi6 и требуется для рекрутирования когезина к центромерам (Bailis et al, 2003). Эта функциональная связь между гетерохроматином и когезией хроматид, по-видимому, сохраняется и у других организмов, поскольку уменьшение содержания компонента RNAi, Dicer, по-видимому, влияет на целостность гетерохроматина и когезию сестринских центромер в клетках позвоночных (Fukagawa et al., 2004).

1.8. Эпигенетическое наследование функционального состояния центромеры

Интересное эпигенетическое явление было описано в отношении сборки функциональных центромер у дробянковых дрожжей на плазмидах, содержащих минимальные участки для центромерной функции. Хотя конструкты, сохраняющие лишь часть внешнего повтора и большую часть центрального домена, собирают функциональную центромеру неэффективно, но, как это ни удивительно, коль скоро это активное функциональное состояние центромеры установлено, оно может воспроизводиться в ряду многих митотических делений и даже в мейозе (Steiner and Clarke, 1994; Ngan and Clarke, 1997). Одно из объяснений этого сводится к тому, что внешние повторы обеспечивают среду, благоприятную для сборки кинетохора (Pidoux and Allshire, 2005), но, будучи собранным, CENP-A^Cnp1-хроматин (и, следовательно, кинетохор) воспроизводится в этом положении с помощью матричного механизма, который может быть сопряжен с репликацией (Takahashi et al., 2005). Возможно, что гетерохроматин каким-то образом индуцирует откладку CENP-A^Cnp1 в центральном домене или способствует ей (рис. 6.8) и что один только блок гетерохроматина не обеспечивает эффективную сборку кинетохора. Альтернативное объяснение заключается в том, что один внешний повтор не достаточен для рекрутирования достаточных количеств когезина, и это приводит к дефектной центромерной когезии и повышенным частотам утери хромосом. Такие центромерные конструкты после нескольких клеточных делений могут стохастически накапливать достаточные количества когезина, результатом чего оказывается увеличенная митотическая стабильность. Однажды достигнутое, это стабилизированное состояние должно каким-то образом дуплицироваться на дочерних молекулах, чтобы сделать возможным его воспроизведение в последующих делениях (рис. 6.8).