Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 6.7. Утрата гетерохроматина приводит к дефектному расхождению хромосом

^{(а) Клетки, лишенные RNAi или компонентов гетерохроматина, обнаруживают увеличенную частоту хромосомных потерь и отстающих хромосом на веретенах в поздней анафазе, (б) Отстающие хромосомы в клетках с дефектным гетерохроматином могут быть результатом дезорганизации кинетохоров, так что одна центромера может прикрепляться к микротрубочкам от противоположных полюсов. Такая меротелическая ориентация могла бы сохраняться при переходе в анафазу; разрыв прикрепления к одному или другому полюсу приводил бы к случайной сегерегации, результатом чего были бы случаи потери-приобретения хромосом}

Рис. 6.8. Установление и поддержание хроматина CENP-A

^{ДНК центрального домена сама по себе не способна устанавливать функциональную центромеру; необходимы внешние повторы. Утрата гетерохроматина из установленных центромер не влияет на сборку CENP-ACnp1 или кинетохора на центральном домене. Это позволяет предполагать, что гетерохроматин каким-то образом указывает сайт CENP-ACnp1-хроматина и, тем самым, сборки кинетохора. Неизвестно, как CENP-ACnp1-хроматин откладывается в нуклеосомах или каким образом этот специализированный хроматин поддерживается в центральном домене}

Как упоминалось выше, TSA также может устанавливать дефектное по центромере состояние, вызываемое утратой сайленсинга (Ekwall et al., 1997). С учетом связи между формированием «молчащего» хроматина и когезией в центромерах представляется вероятным, что индуцированное TSA гиперацетилирование блокирует эффективную реконструкцию «молчащего» хроматина посредством RNAi и что дефектная функция центромеры воспроизводится благодаря утрате сайленсинга и, таким образом, когезии сестринских центромер (дополнительные детали см. в главе 14).

1.9. Различные механизмы сайленсинга у грибов

В первой половине этой главы мы описали, как у одного, относительно простого эукариотного организма, дробянковых дрожжей S. pombe, репортерные гены сайленсируются двумя разными типами хроматина в центромерах. Хроматин CENP-A расположен в середине центромеры и фланкирован с обеих сторон блоками гетерохроматина. Хроматин CENP-A маркирует район, над которым формируется кинетохор, предположительно прикрепляющийся к микротрубочкам. RNAi используется при формировании фланкирующего гетерохроматина для «нацеливания» некодирующих транскриптов. получаемых с внешних повторов, и поставляет модифицирующие хроматин энзимы, такие как Clr4 (H3K9-метилтрансфераза гистонов), которая создает сайты связывания для хромодоменных белков и, тем самым, прочного сайленсинга. Этот гетерохроматин участвует в центромерной функции, обеспечивая плотную физическую когезию и, возможно, способствуя организации кинетохора. Использование RNAi в формировании «молчащего» хроматина в центромерах может быть производным от ее роли в защите генома от РНК-вирусов и мобильных элементов, как это было описано у растений. В самом деле, возможно, что сами центромерные повторы являются остатками древних мобильных элементов.

В пользу этой возможности говорят ранние исследования центромер нитчатого гриба N. crassa — объекта второй половины этой главы. Хотя у пары разных грибов, представленных в этой главе, работают несомненно общие эпигенетические механизмы, ясно, что эти грибы демонстрируют серьезные различия, как это описано ниже. Например, в отличие от хорошо изученных почкующихся и дробянковых дрожжей Neurospora использует метилирование ДНК — классический эпигенетический процесс, общий для таких высших эукариот, как млекопитающие и цветковые растения Кроме того, исследования на Neurospora вскрыли несколько независимых систем сайленсинга, действующих на разных стадиях ее жизненного цикла. Первый такой механизм, названный механизмом точечных мутаций, индуцируемых повторами (RIP — repeat-induced point mutation), имеет как эпигенетические, так и генетические аспекты и несомненно служит в качестве системы защиты генома. Второй механизм, названный механизмом подавления (quelling), представляет собой основанный на RNAi механизм, который приводит к сайленсингу трансгенов и их нативных гомологов. Третий, названный мейотическим сайленсингом с помощью неспаренной ДНК (MSUD — meiotic silencing by unpaired DNA), также базируется на RNAi, но отличается от подавления (quelling) временем своего действия, мишенями и предполагаемой целью. Хотя мы все еще находимся в начале эпигенетических исследований у всех организмов, включая модельные грибы, представленные в этой главе, уже ясно, что S. pombe и N. crassa будут по-прежнему служить богатым источником информации по эпигенетическим механизмам, действующим у эукариот.

2. Neurospora crassa: история и особенности организма

Нитчатый гриб Neurospora crassa (рис. 6.9 и 6.10) впервые сделан экспериментальным организмом Доджем (Dodge) в конце 1920-х годов и примерно 10 годами позже приспособлен Бидлом и Тейтумом (Beadle и Tatum) для своих знаменитых исследований в рамках концепции «один ген — один белок», связывающих биохимию и генетику (Davis, 2000). Бидл и Тейтум выбрали Neurospora отчасти потому, что этот организм быстро растет и легко размножается на ростовых средах определенного состава, а также потому, что на Neurospora просто выполнять такие генетические манипуляции, как мутагенез, тесты на комплементацию и картирование. Neurospora, хотя и не столь широко используется, как некоторые модельные эукариоты, продолжает привлекать исследователей в силу ее умеренной сложности и потому, что она хорошо подходит для разнообразных генетических, эмбриологических [developmental] и субклеточных исследований (Borkovich et al., 2004). Neurospora оказалась особенно полезной для исследований по фотобиологии, циркадным ритмам, популяционной биологии, морфогенезу, митохондриальному импорту, репарации и рекомбинации ДНК, метилированию ДНК и другим эпигенетическим процессам.

Жизненный цикл N. crassa проиллюстрирован на рис. 6.9. Вегететивная фаза начинается, когда либо половая спора (аскоспора), либо бесполая спора (конидий) прорастают, давая начало многоядерной клетке, которая формирует разветвляющиеся нити (гифы; рис. 6.10В). Два типа спаривания (А и а) морфологически неразличимы (рис. 6.10Б). Для прорастания аскоспор требуется тепловой шок, что удобно, тогда как конидии прорастают спонтанно. Система гиф быстро распространяется (линейный рост >5 мм в час при 37°С), образуя «мицелий». После того как мицелий хорошо развился, образуются воздушные гифы, продуцирующие многочисленные оранжевые конидии, характерные для этого организма (рис. 6.10А,Б). Конидии, содержащие от одного до нескольких ядер каждый, могут либо служить началом новых вегетативных культур, либо осуществлять оплодотворение в скрещиваниях. Если питательные вещества ограничены, Neurospora готовится вступить в половую фазу своего цикла, продуцируя заново образующиеся плодовые тела («протоперитеции»). Когда специализированная гифа («трихогина»), выступающая из протоперитециума, контактирует с тканью противоположного типа спаривания, ядро подхватывается [is picked up] и транспортируется обратно в протоперитеций. Половая фаза Neurospora и других нитчатых аскомицетов отличается от таковой у дрожжей тем, что имеет продолжительную гетерокариотическую фазу между оплодотворением и кариогамией (слиянием ядер). Гетерокариотические клетки, получающиеся в результате оплодотворения, разрастаются в развивающийся перитеций. При конечных делениях эти клетки двухъядерные и содержат по одному ядру каждого типа спаривания. Эти клетки изгибаются, образуя крючковидные клетки («crazier» — «епископский посох»), происходит последний митоз, дающий четыре ядра, и создаются септы, давая одну двухъядерную клетку в крючке «посоха». Эта клетка дает начало аску. Генетический анализ показал, что, в целом, -100 асков (или более) перитеция происходят от одного материнского и одного отцовского ядра. Когда происходит кариогамия, получающееся диплоидное ядро немедленно вступает в мейоз. Таким образом, диплоидная фаза жизненного цикла непродолжительна и ограничена одной клеткой. Продукты мейоза претерпевают одно митотическое деление, а затем упаковываются в аскоспоры и в развивающихся аскоспорах проходят дополнительные митозы (см. рис. 6.9 и Davis, 2000).

Рис. 6.9. Жизненный цикл N. crassa

^{Указываются стадии, на которых происходят эпигенетические процессы, описанные в тексте (с любезного разрешения, из: Shiii et al. 2001, с изменениями)}

Геном N. crassa (~40 млн о.) состоит из семи хромосом с примерно 10000 предсказанными генами, кодирующими белки (Galagan et al., 2003), и общей длиной генетической карты, равной, огрубленно, 1000 единицам (Perkins et al., 2001). Лишь около 10 % этого генома состоят из повторяющейся ДНК, и, помимо тандемного порядка из -70 копий сегмента рДНК длиной ~9 т.н., кодирующего три большие рРНК, большая часть повторяющейся ДНК состоит из инактивированных перемещающихся элементов. Тот факт, что большинство штаммов Neurospora не имеет активных транспозонов и имеет очень мало близких паралогов, почти наверняка отражает действие RIP, первой открытой у эукариот системы защиты генома, зависящей от гомологии (Selker, 1990). Мы знаем, что у Neurospora имеются по крайней мере три процесса сайленсинга генов, которые должны служить для консервации структуры генома: RIP, подавление (quelling) и MSUD (Borkovich et al., 2004). У всех этих процессов имеются эпигенетические аспекты и все они имеют прямые или косвенные связи с метилированием ДНК — базовым эпигенетическим механизмом, обнаруживаемым у Neurospora и многих других эукариот. Мы обсудим метилирование ДНК, а затем RIP, подавление (quelling) и MSUD.

2.1. Метилирование ДНК у Neurospora

Со времени своего открытия десятилетия тому назад метилирование ДНК у эукариот остается в высшей степени загадочным. Все еще вызывают споры такие базовые вопросы, как вопрос о том, что определяет, какие именно хромосомные районы метилируются, и какова функция метилирования ДНК. Neurospora проявила себя как превосходная система для изучения контроля и функции метилирования ДНК. У некоторых модельных эукариот, в том числе нематоды С. elegans и дрожжей S. cerevisiae и

S. pombe, сколько-нибудь заметное метилирование ДНК отсутствует, а сообщения о метилировании ДНК у еще одного модельного организма, D. melanogaster, остаются спорными. У некоторых организмов, таких как млекопитающие, метилирование ДНК имеет существенное значение для выживаемости, усложняя некоторые анализы. В ДНК Neurospora около 1,5 % цитозинов метилированы, но этим метилированием можно пренебречь, что облегчает генетические исследования. Хотя следует быть осторожным при экстраполяции с одной системы на другую, по крайней мере некоторые аспекты метилирования ДНК оказываются консервативными. Например, все известные ДНК-метилтрансферазы (DMTs), включая DMTs и прокариот, и эукариот, обнаруживают поразительную гомологию в своих каталитических доменах (Grace Goll and Bestor, 2005). Полученные за последнее десятилетие данные по Neurospora, Arabidopsis, мышам и другим системам выявили как важное сходство, так и интересные различия в контроле и функциях метилирования ДНК, демонстрируя ценность проведения исследований на многих модельных системах.

Рис. 6.10. Изображения N. crassa

^{(А) Вегетативный рост в природных условиях на сахарном тростнике (фото D. Jackobson; Stanford University)}

^{(Б) Агаровые «косяки» с вегетативными культурами N. crassa в лаборатории (фото N.B.Raju, Stanford University)}

^{(В) Гифы N. crassa, окрашенные DAPI, чтобы показать многочисленные ядра (фото М. Springer, Stanford University).}

^{(Г) Розетка созревающих асков, демонстрирующая разные паттерны аскоспор. (Г перепечатано, с любезного разрешения, из: Raju, 1980 [©Elsevier])}

Открытие метилирования ДНК у Neurospora первоначально вызвало интерес в связи с тем, что оно не было ограничено симметричными сайтами, такими как динуклеотиды CpG или тринуклеотиды CpNpG. Риггс (Riggs), а также Холлидей и Нью (Holliday и Pugh), предложили привлекательную модель для «наследования» или «поддержания» паттернов метилирования, базирующуюся на симметричной природе метилированных сайтов у животных. Хотя результаты разнообразных исследований in vitro и in vivo были в пользу модели «поддерживающей метилазы» (глава 18), можно представить себе и механизмы поддерживающего метилирования, которые не основываются на точном копировании в симметричных сайтах; такие механизмы могут действовать у ряда организмов (см., например: Selker et al., 2002). Вероятность того, что наблюдаемое метилирование в асимметричных сайтах представляло собой «метилирование de novo», казалась очень привлекательной, потому что механизмы, слепо воспроизводящие паттерны метилирования, могут усложнять определение нуклеотидных последовательностей, метилируемых изначально [in the first place]. Действительно, проведенные на Neurospora исследования с ДНК-опосредованной трансформацией и ингибиторами метилирования продемонстрировали воспроизводящееся метилирование de novo (см., например: Singer et al., 1995). Дополнительные исследования определили, отчасти, основные сигналы для метилирования de novo (см., например: Tamaru and Selker, 2003).

Рис. 6.11. Индуцированная повторами точечная мутация (RIP)

^{Для упрощения показаны лишь две хромосомы. Пустой прямоугольник представляет ген или любой хромосомный сегмент, который во время дупликации (например, в штамме, показанном наверху справа) подвержен R1P (символизируется знаком молнии) между оплодотворением и кариогамией. Результаты генетических экспериментов показывают, что дупликации могут повторно подвергаться залпам транзиций С в Т (символизируются заполненными прямоугольниками) на протяжении этого периода времени, равного -10 митозам, как раз к конечному премейотическому синтезу ДНК [right up to the final premeiotic DNA synthesis] (Selker et al., 1987; Watters et al., 1999). Показаны четыре возможные комбинации хромосом в потомстве, и красное «т» изображает метилирование ДНК, которое часто (хотя и не всегда) связано с продуктами RIP}

Первым метилированным пэтчем, охарактеризованным в деталях, был участок длиной 1,6 т.о., который состоит из дивергировавшей тандемной дупликации сегмента ДНК длиной 0,8 т.о., включающего ген 5S рРНК. Сравнение этого участка с соответствующим хромосомным районом таких штаммов, у которых этой дупликации нет, первоначально привело к идее, что повторяющиеся последовательности могут каким-то образом индуцировать метилирование ДНК, и в конце концов привело к открытию системы защиты генома, названной RIP. Расшифровка RIP показала, что повторяющиеся последовательности не могут прямо включать метилирование ДНК, по крайней мере у Neurospora; вместо этого повторы включают RIP, который тесно связан с метилированием ДНК, как описано ниже. И район ?-?, и район ?63, второй метилированный район, открытый у Neurospora, являются продуктами RIP. Более того, последующие анализы метилирования ДНК по всему геному обнаружили, что большинство метилированных участков у Neurospora являются реликтами транспозонов, инактивированных RIP (Galagan et al., 2003; Selker et al., 2003). Действительно, единственное метилирование ДНК у Neurospora, которое , возможно, не является результатом RIP, — это метилрование в тандемных порядках рРНК (Perkins et al., 1986).