Эпигенетика: читать книгу онлайн полностью и бесплатно

Рис. 6.1. Жизненный цикл дробянковых дрожжей S. pombe

^{Дробянковые дрожжи имеют короткую G1, занимающую менее 10 % клеточного цикла (покрытая пунктиром площадь расширена для облегчения восприятия). В богатой питательными веществами среде клетки, находящиеся в фазе G1, переходят в фазу S. за которой следуют длительная G2 (-70 % клеточного цикла), митоз и цитокинез. В условиях азотного голодания клетки противоположных типов спаривания (+ и -) конъюгируют, после чего ядра сливаются в процессе, называемом кариогамией. Премейотическая репликация и рекомбинация делают возможным прохождение мейоза I и II; в результате образуются четыре ядра, которые обособляются в четыре споры, заключенные в аск. Перенос в среду, богатую питательными веществами, вызывает прорастание спор и возобновление вегетативного клеточного цикла}

Подобно S. cerevisiae, S. pombe может переключаться с одного из противоположных типов спаривания на другой; эти типы спаривания называются Плюс (+) и Минус (-). Типы спаривания эквивалентны диморфным полам у высших эукариот, хотя они гаплоидны. Информация для обоих типов спаривания находится в геноме в виде эпигенетически регулируемых «молчащих» кассет — локусов mat2-Р(+) или mat3-М(-). Эти «молчащие» локусы обеспечивают генетическую матрицу для идентичности по типу спаривания, но сам тип спаривания определяется тем, какая конкретная информация (+ или -) находится в активном локусе mat1 Переключение информации в активном локусе mat1 (и, следовательно, типа спаривания) происходит путем рекомбинации между «молчащим» локусом и локусом mat1 в соответствии со строгим паттерном (Egel, 2004). В условиях азотного голодания клетки перестают делиться и останавливаются в G,, что активирует половую фазу жизненного цикла — конъюгацию пар клеток + и — с образованием диплоидных зигот (рис. 6.1). После спаривания и слияния ядер происходит премейотическая репликация (увеличивающая содержание ДНК с 2N до 4N). затем происходят спаривание и рекомбинация гомологичных хромосом, и за этим следует редукционное деление мейоза 1 и эквационное деление мейоза II. Это дает четыре отдельных гаплоидных ядра (1N), которые инкапсулируются в споры, заключенные в аск. Последующее предоставление богатого источника питательных веществ делает возможным прорастание спор и возобновление вегетативного роста и митотического деления клеток.

Были изолированы или сконструированы непереключающиеся дериваты, у которых все клетки относятся либо к «+»-, либо к «-»-типу спаривания. Это облегчает контролируемое спаривание между штаммами разных генотипов. Хотя в норме S. pombe гаплоидны, можно отселектировать диплоидные штаммы Такие диплоидные клетки могут затем делиться митозом в ходе вегетативного роста до начала азотного голодания, когда они также претерпевают мейоз и образуют «азиготические аски» (рис. 6.1).

1.1. Сайленсинг хроматина у S. pombe отличается от такового у S. cerevisiae

Дробянковые дрожжи являются очень полезным модельным организмом для изучения «молчащего» хроматина и связанных с этим эпигенетических эффектов. Они непохожи на S. cerevisiae, но более сходны с N. crassa, растениями и многоклеточными животными в отношении механизмов, которые они используют для достижения сайленсинга через гетерохроматин. И у S. cerevisiae, и у S. pombe теломеры и районы локусов типа спаривания в геноме подвержены сайленсингу, и, кроме того, у S. pombe сайленсинг обнаруживают центромеры. Однако, как описано в главе 4, S. cerevisiae используют для достижения сайленсинга хроматина уникальный набор белков — белки Sir. С другой стороны, дробянковые дрожжи и другие эукариоты, по-видимому, используют сочетание различных модификаций гистонов (в частности, метилирование гистона H3K9) и белки РНК-интерфернции (RNAi) для того, чтобы сайленсировать хроматин. Как детально обсуждается ниже, в исследованиях на S. pombe обнаружили, что этот «молчащий» хроматин имеет существенное значение для функционирования каждого специализированного района гетерохроматина (т.е. центромер и локусов типа спаривания). В центромерах гетерохроматин необходим для обеспечения нормального расхождения хромосом (Allshire et al., 1995; Ekwall et al., 1995), тогда как в локусах типа спаривания он облегчает и регулирует переключение типа спаривания (обзор см. Egel, 2004). Кроме того, «молчащий» хроматин формируется по соседству с теломерами, хотя для этого теломерного «молчащего» хроматина еще нужно найти функцию (Nimmo et al., 1994; Kanoh et al., 2005). Маркерные гены, вставленные в рДНК, тоже сайленсируются (Thon and Verhein-Hansen 2000; Cam et al., 2005).

В отличие от N. crassa и высших эукариот, у S. pombe, по-видимому, отсутствует сколько-нибудь заметное метилирование ДНК (Wilkinson et al., 1995) — обычный механизм, используемый для сайленсирования хроматина у многих эукариот (главы 9 и 18); так, сайленсинг у дробянковых дрожжей опосредован главным образом модификациями хроматина. Как обсуждается ниже, для установления этих модификаций и, таким образом, «молчащего» хроматина используется машинерия RNAi.

1.2. Гены, помещенные в центромеры дробянковых дрожжей, сайленсированы

Формирование гетерохроматина в центромерах дробянковых дрожжей важно для обеспечения нормального расхождения хромосом при делении ядра. Исследования показали, что центромера в действительности состоит из двух различных хроматиновых структур: гетерохроматина и содержащего CENP-Акинетохорного хроматина Это было продемонстрировано путем изучения варьирующего сайленсинга репортерных генов, вставленных в разные центромерные участки.

На уровне ДНК центромерные районы у дробянковых дрожжей состоят из внешних [outer] повторов (подразделенных на элементы, известные как dg и dh, или К и L), которые фланкируют центральный домен, включающий внутренние [inner] повторы (imr, или В), и центральный кор (cnt, или СС) (рис. 6.2а). Три центромеры, сеп 1, cen2 и cen3, занимают -40, -60 и -120 т.о. на хромосомах I, II и III, соответственно (обзоры см. Egel, 2004; Pidoux and Allshire, 2004). Повторяющаяся природа центромерной ДНК у дробянковых дрожжей напоминает более крупные, более сложные повторяющиеся структуры, связанные с центромерами многих многоклеточных животных, но с ними легче манипулировать (Takahashi et al., 1992; Steiner et al., 1993; Ngan and Clarke, 1997). Поскольку у других эукариот повторяющаяся ДНК часто коррелирует с присутствием гетерохроматина (см. также главу 5), наличие повторяющейся ДНК в центромерах дробянковых дрожжей позволяет предполагать, что они могли бы обладать такими свойствами гетерохроматина, как способность препятствовать экспрессии генов. Как описывается ниже, два блока гетерохроматина фланкируют центральный домен каждой центромеры дробянковых дрожжей. Сам этот центральный домен собран в хроматин другого типа (CENP-A-хроматин), который отличается от соседнего гетерохроматина.

Хорошо известно, что тип хроматина, окружающего ген, может сильно влиять на его экспрессию. Первоначально это было продемонстрировано у плодовой мушки Drosophila melanogaster, где хромосомные перестройки, перемещающие ген white в соседство с центромерным гетерохроматином, приводят к его варьирующей экспрессии в глазных фасетках и, таким образом, к мозаичной окраске глаза (см. рис. 5.1 в главе 5). Сейчас очевидно, что трансгены у многих организмов могут испытывать влияние того окружения, в котором они оказались.

У дробянковых дрожжей сайленсинг генов можно отслеживать с помощью фенотипических тестов, подобных тем, которые используются у S. cerevisiae и оценивают экспрессию репортерных генов. Например, когда репортер ura4+ сайленсирован, формируются колонии, резистентные к 5-фтороротовой кислоте. Другой пример: сайленсинг репортера ade6+ приводит к образованию красных, а не белых колоний (рис. 6.3а). Перемещение нормально экспрессирующегося гена, такого как ura4+ или ade6+, внутрь центромеры (что определяется по элементам внешних повторов и центрального домена) приводит к его транскрипционному сайленсингу. Сайленсинг во внешних повторах очень прочный — такой, что большинство клеток формируют колонии, в которых стабильно поддерживается репрессия маркеров (т.е. в случае репортера ade64 формируются красные колонии). Однако в центральном домене сайленсинг ade6+ сравнительно нестабилен, результатом чего являются мозаичные колонии, выглядящие как секторированные колонии с красными, белыми либо краснобелыми секторами (рис. 6.3а). Однако на расстоянии всего 1 т.о. дистально от внешних повторов никакого сайленсинга не происходит (Allshire et al., 1994, 1995), показывая тем самым, что эта репрессия транскрипции ограничена центромерой, определяемой центральным доменом и фланкирующими внешними повторами.

Рис. 6.2. Отличающийся гетерохроматин внешних повторов и центральные кинетохорные домены в центромерах дробянковых дрожжей

^{(а) Изображение центромеры дробянковых дрожжей. Центральный домен (розовый цвет, кинетохор) состоит из элементов imr и cnt, внешние повторы содержат транскрибируемые повторы dg и dh (зеленый цвет, гетерохроматин) Все три центромеры имеют сходное общее устройство; однако число внешних повторов различается: cenl (10 т.о.) имеет два, cen2 (65 n/j/) имеет три и cen3 — приблизительно тринадцать. Кластеры генов тРНК (двойные концы стрелок) находятся в районе imr и на концах всех трех центромер. Транскрипция маркерных генов, помещенных внутрь внешних повторов или в центральный домен, сайленсируется. (b) Гетерохроматин: внешние повторы упакованы в нуклеосомы, которые метилированы по H3K9me2, что делает возможным связывание хромодоменных белков Chp1, Chp2 и Swi6. Центральный «кинетохорный» хроматин: CENP-A обнаруживается в центральном домене, где он, вероятно, замещает большую часть H3, чтобы сформировать специализированные нуклеосомы (розовые квадратики). Было показано, что, в дополнение к CENP-A, несколько кинетохорных белков (указаны) связываются с нуклеотидными последовательностями центрального домена, но не с внешними повторами. Сборка кинетохора в центральном домене опосредует прикрепление к микротрубочкам после образования веретена и расхождение хромосом. Мутация компонентов гетерохроматина облегчает сайленсинг маркерных генов во внешних повторах, но не в центральном домене. Дефекты в некоторых компонентах кинетохора делают возможной экспрессию маркерных генов в центральном домене, но не во внешних повторах}

1.3. Центромеры дробянковых дрожжей состоят из разных гетерохроматиновых и центральных кинетохорных доменов

У дробянковых дрожжей разница в качестве сайленсинга по длине центромер отражает тот факт, что репрессия транскрипции является результатом разных хроматиновых структур, включая ассоциации различных негистоновых белков, во внешних повторах и в центральном домене (Partridge et al., 2000). Имеются две разные хроматиновые структуры, которые были охарактеризованы в центромерных районах дробянковых дрожжей: гетерохроматин над участками внешних повторов и хроматин «CENP-А», покрывающий центральный домен, где собирается кинетохор. В этих двух доменах с сайленсингом репортерных генов связаны (и для него требуются) разные белки.

Гетерохроматин

В хроматине аминотерминальные «хвосты» гистонов H3 и Н4 подвержены ряду посттрансляционных модификаций, которые обычно коррелируют с активными или репрессивными состояниями (глава 3). Центромерный гетерохроматин во внешних повторах ассоциируется с ди- и триметильными состояниями гистона H3 по лизину 9 (H3K9me2 и H3K9me3) (Nakayama et al., 2001; Yamada et al., 2005). Для формирования центромерного гетерохроматина требуется действие нескольких белков, модифицирующих хроматин и, тем самым, стимулирующих связывание других факторов. Для формирования гетерохроматина сначала требуются деацетилазы гистонов (HDACs; такие как ClrЗ, Clr6 и Sir2), чтобы деацетилировать гистон H3. Это впоследствии позволяет метил-трансферазе лизина гистонов (HKMT) Clr4 метилировать гистон H3 по лизину 9 над центромерными внешними повторами. Эта модификация создает специфический сайт связывания, который распознается хромодоменным мотивом, присутствующим в Swi6 и Chp2 (гомологах гетерохроматинового белка 1 [НР1], описываемого в главе 5) и в еще одном хромодоменном белке Chp1 (рис. 6.26). Все эти белки вносят вклад в формирование «молчащего» хроматина над внешними повторами (Allshire et al., 1995; Cowieson et al., 2000; Partridge et al., 2000; Bannister et al., 2001; Nakayama et al., 2001; Shankaranarayana et al., 2003; Sadaie et al., 2004).

Рис. 6.3. Мозаицизм и облегчение сайленсинга маркерных генов

^{(а) Экспрессия ade6+ из центрального домена носит мозаичный характер, давая в результате красные, белые и секторированные колонии. Клетки, экспрессирующие ade6+, образуют белые колонии; когда же ade6+ репрессирован, образуются красные колонии, (б) ade6+, вставленный во внешние повторы, накрепко сайленсирован, что в результате дает однородные красные колонии. Для этого сайленсинга требуются белки гетерохроматина, такие как Swi6 (который связывается с метилированным H3K9). и компоненты RNAi, такие как Dcr1 (Dicer, РНКаза-III-рибонуклеаза)}

Хроматин, ассоциированный со вставками репортерного гена во внешние повторы (например, гена ura4+), заметно обогащен белками H3K9me2 и Swi6. Это показывает, что модификация хроматина и Swi6 могут распространяться из соседней центромерной повторяющейся ДНК в вклинивающиеся [interposing] последовательности (Cowieson et al., 2000; Nakayama et al., 2001). Локализация Swi6 и сайленсинг зависят от метилирования H3K9, что иллюстрируется нарушением локализации Swi6 в клетках, у которых нет специфичной для H3K9 HKMT, Clr4, или у мутантов по H3, где лизин 9 замещен аргинином (Ekwall et al., 1996; Mellone et al., 2003). Белок Swi6 димеризуется через свой «chromoshadow»-домен (Cowieson et al., 2000) и это, вероятно, облегчает его распространение вдоль хроматиновых фибрилл, которому способствует последовательное действие HDACs и специфичной для H3K9 HKMT Clr4.

Кроме Swi6, с хроматином внешних повторов в центромерах ассоциируются также хромодоменные белки Chp1 и Chp2 путем связывания гистона H3, метилированного по лизину 9. Было показано, что Chp1 является компонентом эффекторного комплекса RNAi, RITS (глава 8), и необходим для полного метилирования гистона H3K9 над внешними повторами и вставленными репортерными генами (Partridge et al., 2002; Motamedi et al., 2004; Sadaie et al., 2004).

Хроматин центрального кинетохорного домена

Прежде чем обсуждать детали формирования гетерохроматина на внешних повторах в центромерах, важно принять во внимание, что хроматин центрального домена, где собирается кинетохор, очень отличается от гетерохроматина, фланкирующего внешние повторы, потому что именно там собирается кинетохор. В противоположность сайленсингу во внешних повторах сайленсинг репортерных генов в центральном домене сеп 1 (имеющем длину приблизительно 10 т.о.), по существу, не зависит от Clr4 и поэтому не связан с метилированием гистона H3 по лизину 9. Действительно, было показано, что центральный домен обладает отличающимся составом хроматина. Первоначально это было продемонстрировано в ходе анализа с использованием микрококковой нуклеазы, MNase (объяснение ее действия см. в главе 5), когда обнаружили «мазок» [smear] в противоположность регулярной «лесенке» с интервалом 150 п.н., характерной для хроматина фланкирующих внешних повторов (Polizzi and Clarke, 1991; Takahashi et al., 1992). Этот особый паттерн отличает хроматин центрального домена от гетерохроматина и эухроматина и имеет отношение к его сборке в особом CENP-A-хроматине и сборке кинетохора над этим районом. У всех изученных эукариот с активными центромерами специфически связывается белок, подобный гистону H3 и известный как CTNP-A (или сепH3), (Cleveland et al., 2003), а CENP-A-хроматин играет решающую роль в определении места сборки кинетохора (рис. 6.26).

В хроматине центрального домена центромер у дробянковых дрожжей большая часть гистона H3 замещена ортологом CENP-A, известным как Cnp1 (рис. 6.46) (Takahashi et al., 2000). Откладка CENP-ACnp1 может происходить зависимым от репликации образом в фазе S или независимым от репликации способом в G2 (дополнительные детали см. в главе 13). Кинетохорные белки сами управляют локализацией и сборкой CENP-ACnp1 специфически в пределах центрального домена центромеры (Goshima et al., 1999; Takahashi et al., 2000; Pidoux et al., 2003). Ams2 (фактор GATA), например, управляет связанной с репликацией откладкой CENP-ACnp1 в фазе S. В его отсутствие независимая от репликации откладка с помощью Mis6 в G2 может обеспечивать компенсацию, доводя уровни CENP-ACnp1 до максимума в интерфазе (Chen et al., 2003; Takahashi et al., 2005). Если структура хроматина CENP-ACnp1 разрушается (как в случае мутантов cnpl, mal2, mis6, sim4 и других), специфический «смазанный» паттерн, получаемый при обработке ми-крококковой нуклеазой, превращается в паттерн, более типичный для основной массы хроматина (т.е. в нуклеосомную «лесенку»). Мутанты, затрагивающие хроматин центрального домена, не оказывают никакого заметного влияния на сайленсинг во внешних повторах (Cowieson et al., 2000; Jin et al., 2002; Pidoux et al., 2003; Hayashi et al., 2004). Более того, тот факт, что CENP-ACnp1, Ма12, Mis6, Sim4 и другие кинетохорные белки связываются только с центральным доменом, показывает, что центральный кинетохорный домен является структурно сложным и функционально отличается от «молчащего» хроматина внешних повторов (рис. 6.26).

Были протестированы не все белки кинетохорного домена, но создается впечатление, что сайленсинг в центральном домене является результатом сборки интактного кинетохора, который, как и у S. cerevisiae, включает по меньшей мере 50 белков (Measday and Hieter, 2004). Этот крупный комплекс белков предположительно ограничивает доступ РНК-полимеразы II к репортерным генам, помешенным в этот район, и тем самым тормозит их транскрипцию. У таких мутантов, как cnpl, mal2, mis6 и sim4, при пермиссивной температуре целостность кинетохора, несомненно, частично нарушена, и это делает возможной увеличенную транскрипцию репортерных генов. Побочный результат этого состоит в том, что в норме «молчаший» репортерный ген был использован для тестирования дефектов в хроматине центрального кора, что привело к идентификации новых кинетохорных белков (Pidoux et al., 2003).

Рис. 6.4. «Молчащий» хроматин в ядрах S. pombe